的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素1(2的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素K2 (menaquinone,簡寫為MK，甲萘醌類)，是一種具有葉綠醌生物活性的萘醌基團(tuán)的衍生物，脂溶性維生素。依據(jù)C-3上異戊二烯側(cè)鏈長度的不同，MK共有14種，通常以MK-n表示，其中η指的是側(cè)鏈上異戊二烯單元的個數(shù)。ΜΚ-4，ΜΚ_7，ΜΚ-9生物活性均大幅高于維生素Κ1。在人體正常代謝和腸胃功能正常狀態(tài)時，維生素Kl和維生素Κ3、維生素Κ4將在腸道正常菌群參與下轉(zhuǎn)化為維生素Κ2活性體后才會被腸道吸收利用。維生素Κ2具有良好的促進(jìn)凝血、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的功效.
[0003]能夠進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)維生素Κ2的菌種有屬于革蘭氏陰性菌的黃桿菌(Flavobacterium.sp)，主要產(chǎn)MK-4和MK-6 ;屬于革蘭氏陽性菌的枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis natto，日本文獻(xiàn)稱之為納豆菌)，主要產(chǎn)MK-7。另外據(jù)報道一些乳酸桿菌在脫脂奶粉和豆奶中能產(chǎn)生29-123 μ g/L的MK-8、9、10，但是因為產(chǎn)量較低，一般作為食品添加劑而不能作為發(fā)酵生產(chǎn)使用。
[0004]根據(jù)專利及文獻(xiàn)報導(dǎo)，黃桿菌在發(fā)酵過程中，適當(dāng)表面活性劑可以提高M(jìn)K-4及MK-6的產(chǎn)量。其原因是添加表面活性劑可以使MK-4及MK-6漏出到胞外，能在一定程度上解除產(chǎn)物抑制，從而提高產(chǎn)量。但隨著胞外維生素K2濃度逐漸提高，由胞內(nèi)擴(kuò)散至胞外的速率會下降，進(jìn)而影響產(chǎn)率。而且，維生素K2如何有效提取也是迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素K2的方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素K2的方法，包括如下步驟:種子培養(yǎng)、接種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和靜置分層提取維生素K 2，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，將接種培養(yǎng)后的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入活性成分，所述活性成分由以下組分組成:10g/L-60g/L表面活性劑、5g/L-40g/L甘油和100g/L_250g/L植物油。
[0007]優(yōu)化的，一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素K2的方法，具體包括如下步驟:
[0008](I)種子培養(yǎng)，從保存斜面上取一環(huán)黃桿菌接種于含有50-150mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在溫度為30-37°C條件下，以轉(zhuǎn)速100_200rpm振蕩培養(yǎng)24_48h ；
[0009]所述種子培養(yǎng)基由以下組分組成:l_5g/L葡萄糖、2-10g/L甘油、10-20g/L蛋白胨、1.5-4g/L 酵母提取物、l-4g/L K2HPO4'l-3g/L NaCl 和 0.1-lg/L MgSO4.7H20 ；
[0010](2)接種培養(yǎng)，按接種量5%-10%接入發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30-37°C、條件下，以轉(zhuǎn)速100-200rpm、通氣量0.5-lvvm攪拌培養(yǎng)24-36小時；
[0011]所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組分組成:5-30g/L黃豆粉、0-10g/L葡萄糖、10-20g/L蛋白胨、3-10g/L 酵母提取物、l-3g/L K2HPO4U-4g/L NaCl、0.1-lg/L MgSO4.7H20 ；
[0012](3)發(fā)酵培養(yǎng)，將接種培養(yǎng)后的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10g/L_60g/L表面活性劑、5g/L-40g/L甘油和100g/L-250g/L植物油，且攪拌速率500-800rpm，通氣量1.5-3vvm攪拌，形成水包油微乳，發(fā)酵培養(yǎng)72-96小時；
[0013](4)靜置分層提取，將經(jīng)步驟(3)發(fā)酵培養(yǎng)的混合物停止攪拌，靜置3-5小時分層后，提取上層植物油，油相中含有總維生素K2。
[0014]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，上述步驟(3)中表面活性劑選自蔗糖脂肪酸酯(SE)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯-SO(TweenSO)、聚辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)中的一種或幾種。
[0015]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，上述步驟(3)中植物油選自大豆油，玉米油，花生油，橄欖油、山茶油等中的一種或幾種。
[0016]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素1(2的方法，通過表面活性劑，甘油，植物油，配合高攪拌，高通氣量，在發(fā)酵罐中形成水包油乳液，在提高溶氧及傳質(zhì)的基礎(chǔ)上，使胞外脂溶性的維生素K2被植物油提取，實現(xiàn)原位的發(fā)酵分離偶聯(lián)。發(fā)酵完成后，植物油中含有絕大部分的維生素K2。本發(fā)明在提高維生素K2產(chǎn)量的同時，原位將維生素K2提取至植物油，大大降低后期分離成本，為實現(xiàn)維生素K2的大規(guī)模工業(yè)化原位發(fā)酵分離偶聯(lián)提供了可能。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素1(2的方法的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0018]下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
[0019]實施例1
[0020]一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素1(2的方法，以黃桿菌(Flavobacterium.sp)為發(fā)酵菌株，參見圖1，依次按照下列步驟進(jìn)行操作:
[0021]1.種子培養(yǎng)，從保存斜面上取一環(huán)黃桿菌接種于含有10mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，所述種子培養(yǎng)基由以下組分組成:葡萄糖3g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物 3g/L，K2HP043g/L，NaCl 3g/L，MgSO4.7H20 0.3g/L，pH 自然。在 37°C、以轉(zhuǎn)速 200rpm振蕩培養(yǎng)24h。
[0022]2.接種培養(yǎng)，按接種量5%接入發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組分組成:黃豆粉20g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，K2HP043g/L，NaCl2g/L，MgSO4.7Η20 I g/L ο以培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量0.8vvm，培養(yǎng)時間24小時。
[0023]3.發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中加入50g/L蔗糖脂肪酸酯(SE)，10g/L甘油，150g/L大豆油，攪拌速率提高至600rpm，通氣量提高至2vvm，形成水包油(0/W)微乳，發(fā)酵培養(yǎng)96小時，維生素K2產(chǎn)量約85mg/L。
[0024]4.靜置分層提取，停止攪拌及通氣，靜置5小時，分層后，提取上層大豆油，油相中維生素K2收集率約80%。
[0025]實施例2
[0026]一種基于利用黃桿菌原位發(fā)酵分離偶聯(lián)合成維生素1(2的方法，以黃桿菌(Flavobacterium.sp)為發(fā)酵菌株，參見圖1，依次按照下列步驟進(jìn)行操作:
[0027]1.種子培養(yǎng)，從保存斜面上取一環(huán)黃桿菌接種于含有80mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L，甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物3g/L，K2HP042g/L，NaCl 2g/L，MgSO4.7H20 0.4g/L，pH 自然。在 37°C、搖床 180rpm 振蕩培養(yǎng) 24h。
[0028]2.接種培養(yǎng)，按接種量5%接入發(fā)酵罐。發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆粉30g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨 15g/L，酵母提取物 5g/L，K2HPO41 g/L, NaCl I g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量lvvm