穩(wěn)定的發(fā)酵方法及其多拉菌素組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵和農(nóng)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的發(fā)酵方法及其產(chǎn) 物一一含多拉菌素的組合物，其中還包括多拉菌素的發(fā)酵雜質(zhì)。另外，本發(fā)明還涉及上述組 合物及其中的發(fā)酵雜質(zhì)的應(yīng)用等。
【背景技術(shù)】
[0002] 多拉菌素（Doramectin)，義稱道拉菌素或通滅（Dectomax)，目前作為獸藥，主 要用于治療家畜線蟲病、血虱等外寄生蟲病。例如，中國專利第200910273301號和第 200910273302號分別公開了一種獸用抗寄生蟲的緩釋注射劑和緩釋口服劑，其中可以用已 商品化的多拉菌素作為驅(qū)蟲藥的活性成分；又如，中國專利第201010264540號公開了多拉 菌素微乳透皮劑及其制備方法；而中國專利第201080007929號公開了高劑量多拉菌素制 劑，作為獸醫(yī)用組合物，在保持抗寄生蟲功效的同時顯著降低保留時間。
[0003] 多拉菌素由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，無論發(fā)酵產(chǎn)物是否穩(wěn)定，但是經(jīng)過諸如重結(jié)晶和層 析純化，可以獲得高純度的多拉菌素。目前市售的多拉菌素均為95%純度以上，由于多用于 獸藥，所以純度高，通常達(dá)到98%以上，沒有低純度（如，90%以下）的多拉菌素被提供。
[0004] 本發(fā)明人在自己對多拉菌素的發(fā)酵的多年研宄經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)過長期的艱苦實 驗以及某些偶然的運氣成分，令人驚訝地摸索出了一種多拉菌素的發(fā)酵方法，其能直接生 產(chǎn)含較高純度的多拉菌素的組合物，其中多拉菌素的純度能穩(wěn)定在80%左右，發(fā)酵步驟簡 便、成本低，無需使用諸如重結(jié)晶和層析等純化步驟；更令人驚訝的是，該組合物中除了多 拉菌素外，發(fā)酵產(chǎn)生的部分雜質(zhì)也能起到防治病蟲害的作用，因此直接使用該低成本的組 合物或者使用與雜質(zhì)復(fù)配的多拉菌素，在相同的多拉菌素濃度的情況下，能取得比使用現(xiàn) 有市售的高純度的多拉菌素更佳的病蟲害防治效果，所以特別適宜在防治植物病蟲害中推 廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的含多拉菌素的組合物的發(fā)酵方法及其發(fā) 酵制備的產(chǎn)物和配制成的農(nóng)藥制劑等。另外，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供該產(chǎn)物中 的成分及抗病蟲害應(yīng)用等。
[0006] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了含多拉菌素的組合物的發(fā)酵方法，其包括：
[0007] (1)將鏈霉菌接種于種子培養(yǎng)基（優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基的配方：葡萄糖15g，蔗糖 5g，大豆粉15g，酵母粉5g，pH 7. 0,用蒸餾水定容至1L)中培養(yǎng)（優(yōu)選以30°C培養(yǎng)），得菌 種活化物；
[0008] (2)將菌種活化物接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基（優(yōu)選所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方：葡萄糖10g， 蔗糖l〇g，大豆粉15g，.酵母粉5g，pH 7.0,用蒸餾水定容至1L)中培養(yǎng)（優(yōu)選以30°C培 養(yǎng)），得擴(kuò)大培養(yǎng)物；
[0009] (3)將擴(kuò)大培養(yǎng)物接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：玉米粉50g， 大豆粉 50g，CaC03 5g，NaCl 3g，K2HP04 2g，MgS04 lg，生物素 0? 05g，pH 7. 0,用蒸餾水定容 至1L)中培養(yǎng)（優(yōu)選以28°C培養(yǎng)），得發(fā)酵培養(yǎng)物；和，
[0010] (4)過濾發(fā)酵培養(yǎng)物，保留菌體，加入有機(jī)溶劑（優(yōu)選是醇，如甲醇或乙醇），浸提 后過濾，收集濾液并加入NaCl水溶液（優(yōu)選飽和NaCl水溶液）稀釋有機(jī)溶劑（優(yōu)選稀釋 有機(jī)溶劑濃度至15~35% (V/V))，析出沉淀后過濾，收集沉淀并干燥，即得含多拉菌素的 組合物。
[0011] 經(jīng)本發(fā)明人摸索，本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法簡便、成本低，提純時通過有機(jī)溶劑 浸提和食鹽水沉淀即可析出含多拉菌素的組合物沉淀，提純步驟簡單，所用試劑成本低，無 需采用諸如重結(jié)晶和層析等高成本的步驟。因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法不包括 重結(jié)晶和層析步驟。
[0012] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，種子培養(yǎng)基的體積 <擴(kuò)大培養(yǎng)基的體 積< 發(fā)酵培養(yǎng)基的體積。更優(yōu)選地，種子培養(yǎng)基、擴(kuò)大培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為 1 : 15 ~25 : 100 ~200。
[0013] 在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，步驟（1)、步驟（2)和步驟（3)的培養(yǎng)時間可以 分別是8~24小時，優(yōu)選是10~20小時，如12~16小時。另外，步驟（1)、步驟⑵和步 驟（3)的培養(yǎng)可以是震蕩培養(yǎng)，防止菌體凝聚。
[0014] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，在步驟（4)中，菌體的重量和有機(jī)溶劑的 體積之比（g/mL)為1 : 2~8,優(yōu)選為1 : 3~6。
[0015] 經(jīng)本發(fā)明人摸索的本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法的產(chǎn)物（即，含多拉菌素的組合 物）中多拉菌素的含量能保持穩(wěn)定，通常穩(wěn)定在80%左右，這為直接使用該組合物奠定了 基礎(chǔ)。所以，本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法是穩(wěn)定的發(fā)酵方法。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的發(fā) 酵方法中，含多拉菌素的組合物中多拉菌素的含量為75~85%，優(yōu)選為77~83%。
[0016] 在本文中，如無相反指示，物質(zhì)的含量指的是通過面積歸一法對組合物的HPLC圖 譜中該物質(zhì)的峰面積所占所有峰面積的比例而計算出來的，通常用百分比來表示，這對于 本領(lǐng)域技術(shù)來說是能熟練操作的，事實上，一些商品化的HPLC儀可以直接提供該含量。該 含量基本等于摩爾百分比含量。
[0017] 另外，本發(fā)明人還令人意外地發(fā)現(xiàn)了，含多拉菌素的組合物還含有雜質(zhì)A和雜質(zhì) B，這些雜質(zhì)非但沒有影響該組合物中的多拉菌素的防治植物病蟲害的作用，反而還對防治 植物病蟲害的效果起到了增效的作用。所以，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，含多拉 菌素的組合物還含有雜質(zhì)A和雜質(zhì)B。其中，更優(yōu)選地，雜質(zhì)A的含量為6~9%，優(yōu)選為 6. 5~8% ;也更優(yōu)選地，雜質(zhì)B的含量為2~4%，優(yōu)選為2. 5~3. 5%。
[0018] 盡管還沒有解析出雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是雜質(zhì)A和雜質(zhì)B是客觀確定 的。為了清楚起見，在本文中，雜質(zhì)A被定義為在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法制備的含多拉 菌素的組合物的HPLC圖譜上的17~18min處的峰所對應(yīng)的成分；雜質(zhì)B被定義為在本發(fā) 明第一方面的發(fā)酵方法制備的含多拉菌素的組合物的HPLC圖譜上的12. 9~13. 9min處的 峰所對應(yīng)的成分。相應(yīng)地，多拉菌素也可以被定義為在本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法制備的 含多拉菌素的組合物的HPLC圖譜上的24~26min處的峰所對應(yīng)的成分。
[0019] 在第二方面，本發(fā)明提供了含多拉菌素的組合物，其包含多拉菌素并包含雜質(zhì)A 和/或雜質(zhì)B，即，其可以包含多拉菌素和雜質(zhì)A(優(yōu)選由多拉菌素和雜質(zhì)A組成），可以包 含多拉菌素和雜質(zhì)B (優(yōu)選由多拉菌素和雜質(zhì)B組成），或可以包含多拉菌素、雜質(zhì)A和雜質(zhì) B (優(yōu)選由多拉囷素、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B組成）。
[0020] 優(yōu)選本發(fā)明第二方面的組合物是農(nóng)藥組合物。在本文中，"農(nóng)藥"具有本領(lǐng)域所熟 知的含義，即向植物施用而用于防治植物病蟲害的藥物。
[0021] 優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的組合物中，多拉菌素和雜質(zhì)A的含量比為75~85 : 6~ 9,優(yōu)選為77~83 : 6.5~8。也優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的組合物中，多拉菌素和雜質(zhì)B的 含量比為75~85 : 2~4,優(yōu)選為77~83 : 2. 5~3. 5。
[0022] 本發(fā)明第二方面的組合物可以通過將分離的多拉菌素同雜質(zhì)A和/或雜質(zhì)B復(fù)配 而制備。但是出于成本考慮，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的組合物是由本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方 法制備的。
[0023] 在第三方面，本發(fā)明提供了農(nóng)藥制劑，其包括本發(fā)明第二方面的組合物和農(nóng)藥上 可接受的助劑。農(nóng)藥制劑是有形的產(chǎn)物，可以是水劑、乳劑、粉劑等劑型。在本文中，"農(nóng)藥 上可接受的助劑"指在農(nóng)藥中可以添加而配制形成制劑的增效劑和/或輔料。增效劑通常 是其他農(nóng)藥化合物或農(nóng)藥組合物，可以與本發(fā)明第一方面所述的農(nóng)藥組合物復(fù)配形成農(nóng)藥 制劑；而輔料通常是無抗病蟲活性的試劑，包括載體（如，水）、乳化劑、穩(wěn)定劑、填充劑等。
[0024] 在第四方面，本發(fā)明提供了雜質(zhì)A和/或雜質(zhì)B在防治植物病蟲害（優(yōu)選是蜱螨目 昆蟲、鱗翅目昆蟲、纓翅目昆蟲、線蟲，如花薊馬）中的應(yīng)用；相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了雜質(zhì)A 和/或雜質(zhì)B在制備用于防治植物病蟲害（優(yōu)選是蜱螨目昆蟲、鱗翅目昆蟲、纓翅目昆蟲、 線蟲，如花薊馬）的農(nóng)藥組合物（如，本發(fā)明第二方面的組合物）或農(nóng)藥制劑（如，本發(fā)明 第三方面的農(nóng)藥制劑）中的應(yīng)用。
[0025] 優(yōu)選本發(fā)明第四方面的應(yīng)用是聯(lián)合的應(yīng)用，即，雜質(zhì)A和/或雜質(zhì)B同其他物質(zhì)聯(lián) 合在防治植物病蟲害中的應(yīng)用，或，雜質(zhì)A和/或雜質(zhì)B同其他物質(zhì)聯(lián)合在制備用于防治植 物病蟲害的農(nóng)藥組合物或農(nóng)藥制劑中的應(yīng)用。更優(yōu)選地，本發(fā)明第四方面的應(yīng)用是聯(lián)合多 拉菌素的應(yīng)用，即其他物質(zhì)是多拉菌素。更加優(yōu)選地，其中，多拉菌素和雜質(zhì)A的含量比為 75~85 : 6~9,優(yōu)選為77~83 : 6. 5~8;和/或