用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因分型的引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因分 型的試劑盒（PCR-SSP法)。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)的Dia和Dib相應(yīng)的ISBT符號為DI1和DI2,這是Diego血型系統(tǒng)中最具有 臨床意義的一對抗原.Diego血型系統(tǒng)抗原相應(yīng)的抗-Dia可以引起新生兒溶血病，也可以 破壞輸入的Dia抗原紅細(xì)胞，抗-Dib非常罕見，但同樣能引起新生兒溶血?。℉DN)和溶 血性輸血反應(yīng)，具有臨床意義，Dia和Dib抗原可以用血清學(xué)方法鑒定，但試劑較為昂貴， 特別是抗-Dib定型試劑，市場上更是難以購買，且臨床因產(chǎn)生抗-Dib所引起的輸血問 題，尋找相合的血源是非常困難的，我國隨機(jī)人群中調(diào)查DI1基因頻率為0.0357, DI2基 因頻率為0.9643, Di(a+b_)表現(xiàn)型的人低于千分之一，因此，我們建立了 Diego血型基因 分型技術(shù)，并用于臨床Diego血型的鑒定，以及Di(a+b_)獻(xiàn)血人員的篩檢。
[0003] Diego在1955年被發(fā)現(xiàn)，它因第一個產(chǎn)生抗新血型系統(tǒng)抗原的病人而命名， 這個病人生下了一個患有新生兒溶血病的嬰兒，在其血清中發(fā)現(xiàn)了一種抗體(現(xiàn)稱為 anti-Dia)，這種抗體可以在懷孕期間通過胎盤屏障攻擊胎兒(表達(dá)Dia抗原）的紅細(xì)胞在 1967,第二個diego抗原（Dib)被發(fā)現(xiàn)，直到1995其他的diego抗原相繼被發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)今已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 21種diego抗原，但以Dia和Dib最為重要，它是決定一個人diego血型的關(guān)鍵 因素。Anti-Dia和anti-Dib既可以引起新生兒溶血病又可以引發(fā)輸血不良反應(yīng)，特別是新 生兒溶血病在東南亞和南美普遍是由diego抗體所引起的，因此，通過對diego血型的深入 研究可以預(yù)防新生兒溶血病和因diego血型不合而引起的輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。對實現(xiàn)安 全輸血有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是：克服血清學(xué)檢測試劑的價格昂貴，試劑不好購買等不足，提供一 種免疫學(xué)方法能夠簡單方便的檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的引物組。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、簡便、快速的用于檢測人 類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒。
[0006] 一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的引物組，其特征是包括Di^|物對，Di b 引物對及內(nèi)參引物對。
[0007] 所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和 Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 2所示的 核苷酸序列。
[0008] 所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和 Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3、SEQ ID N0. 2所示的 核苷酸序列。
[0009] -種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有Di^| 物對，Di b引物對及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer。
[0010] 所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和 Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 2所示的 核苷酸序列。
[0011] 所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和 Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3、SEQ ID N0. 2所示的 核苷酸序列。
【附圖說明】
[0012] 圖1為人類紅細(xì)胞Diego血型基因特異引物孔位圖。
[0013] 圖2為實驗結(jié)果陰陽性判讀圖。
[0014] 圖3為人類紅細(xì)胞Diego血型基因測定結(jié)果分型讀板紙。
[0015] 圖4為人類紅細(xì)胞Diego血型基因測定試劑盒Diego電泳結(jié)果膠圖。 具體實施方案
[0016] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0017] 實施例1。
[0018] 依據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫（NCBI Gene Bank)公開的Diego等位基因 序列，設(shè)計出用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的引物組，該引物組包括Di3|物對，Di b 引物對及內(nèi)參引物對。
[0019] 實施例2。
[0020] 一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒，包括包被有Di3|物對，Dib 引物對及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer。
[0021] 用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒的制備方法是： (1) 依據(jù)人類紅細(xì)胞Diego血型基因特異引物孔位圖（見圖1 )，分別將Di3|物對，Di b 引物對及內(nèi)參引物對包被至引物板的相應(yīng)位置上，干燥處理； (2) 依據(jù)配 220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100 制 備出 440 ii 1 濃縮 dNTP-Buf fer; (3) 將包被有引物對的引物板每人份檢測包括2孔特異性引物孔，濃縮dNTP-Buffer組 成一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒。
[0022] 實施例3。
[0023] 使用操作流程。
[0024] 一、2. 5%瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備。
[0025] 1.將加入2. 5g瓊脂糖加入100ml 1XTBE溶液（Tris-硼酸鹽-EDTA溶液)，加熱 直到形成均勻的凝膠溶液。再加入適量電泳染色劑，混合均勻。
[0026]2.將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳。前后水 平移動凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻。
[0027] 3.待凝膠完全凝固后，堅直拔出電泳梳。
[0028] 二、PCR循環(huán)參數(shù)見表1。
[0029] 表1擴(kuò)增參數(shù)特征表。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的引物組，其特征是包括Di3引物對，Dib 引物對及內(nèi)參引物對； 所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； 所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列。
2. -種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有Di3引物 對，Dib引物對及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer; 所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； 所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EX0N18 2541-2561和Intronl8 203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測人類紅細(xì)胞Diego血型基因的引物組及試劑盒。用于Diego血型基因測定的引物組包括Dia引物對，Dib引物對及內(nèi)參引物對。本發(fā)明的試劑盒克服了血清學(xué)方法鑒定Diego血型的種種限制、是正確判定血型不可缺少的輔助手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床參考價值。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104694656
【申請?zhí)枴緾N201510121725
【發(fā)明人】趙衛(wèi)軍
【申請人】天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月20日