識別具有降低免疫原性的抗體的方法
【專利說明】識別具有降低免疫原性的抗體的方法
[0001] 巧關申請案簾叉參考
[0002] 本申請案根據(jù)35U.S.C. § 119(e)主張優(yōu)先權主張對2012年9月19日提出申請 的臨時申請案系列第61/703, 170號的優(yōu)先權，其內(nèi)容的全文W引用方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申請案含有已WASCn格式通過EFS-Web提交且由此全文W引用方式并入本文 中的序列表。在2013年9月17日創(chuàng)建的所述ASCII副本名為381493-721W0(118133)_ 化.txt且大小為6, 980字節(jié)。
【背景技術】
[0005] B細胞表位是由免疫系統(tǒng)的抗體鑒別的分子位點。治療蛋白中B細胞表位的識別 可用于設計在投與患者時不會引發(fā)免疫反應的變體。
[0006]B細胞表位可通過通常利用丙氨酸（丙氨酸掃描）使蛋白質(zhì)的氨基酸個別突變并 測定各突變對抗體結合的效應來識別（翁達的nda)等人，2011，國家科學院院刊（Proc. 化tl.Acad.Sci.) 108(14) : 5742-7)。誘變后破壞蛋白質(zhì)-抗體結合指示突變殘基是由抗 體鑒別的B細胞表位的一部分。已發(fā)現(xiàn)，B細胞表位中的單一突變甚至可消除與一組針 對蛋白質(zhì)的抗體的結合，并且可通過在B細胞表位中引入突變來降低蛋白質(zhì)的免疫原性 (永田（^gata)和派斯坦（Pastan), 2009,高級藥物遞送綜述（AdvancedDrugDelivery Reviews)61:977-985)。然而，此方法還耗時且勞動密集。此外，丙氨酸掃描不一定會識別 可最大降低免疫原性的突變。
[0007] 因此，需要容許識別并消除B細胞表位的簡單的非勞動密集但全面的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供允許對要闡明的參考抗體中所關注區(qū)域內(nèi)的每一氨基酸的免疫原性 貢獻的系統(tǒng)。本發(fā)明提供，參考抗體的任何、一些或所有位置處的氨基酸殘基可突變成其它 19個氨基酸中的一些或全部且評估所述突變對抗體免疫原性的效應。還可評估突變對抗體 的表達水平和/或與祀分子的結合的效應，從而容許識別其中消除或減少免疫原性區(qū)但其 保留有利性質(zhì)（例如，適宜表達水平、與祀分子的結合）的抗體變體。因此，本發(fā)明提供降 低抗體免疫原性的方法。所述方法是基于篩選并識別與抗個體基因型抗體的結合降低的抗 體變體。與抗個體基因型抗體的結合的降低與降低的活體內(nèi)免疫原性相關（例如，參見永 田和派斯坦，2009,高級藥物遞送綜述61:977-985)。
[0009] 本發(fā)明的方法通常包含W下步驟：(a)使宿主細胞庫與特異性結合到參考抗體的 抗個體基因型抗體接觸，所述參考抗體是結合到祀分子的單克隆抗體，所述宿主細胞庫包 含各自在細胞表面上表達與參考抗體相差單一氨基酸點突變的抗體變體的哺乳動物宿主 細胞；化）識別所述宿主細胞庫中表達抗體變體的細胞群體，所述抗體變體展示相對于參 考抗體降低的與抗個體基因型抗體的結合；和（C)識別在所述群體中富集的抗體變體，由 此識別具有降低免疫原性的參考抗體變體。在某些方面中，所述方法需要對宿主細胞庫進 行流式細胞計數(shù)法和使用（例如）英光活化細胞分選（FAC巧從宿主細胞庫分選所述群體。
[0010] 在某些方面中，所述方法進一步包含W下步驟：測定具有降低免疫原性的抗體變 體是否W實質(zhì)上等于或優(yōu)于參考抗體的水平結合到祀分子和/或W實質(zhì)上等于或優(yōu)于參 考抗體表達水平的水平表達。在具體實施例中，結合和表達是通過流式細胞計數(shù)法、磁性珠 粒分選、BIAcore、FACS、ELISA、AlphaLisa或Ki址xA測定，并且是在識別具有降低免疫原性 的抗體變體之前、同時或之后測定。
[0011] 本文所述方法已適用于抗TNF-a抗體D2E7 (還稱作阿達木單抗（Adalimum油)）。 識別與1個、2個或3個不同抗個體基因型抗體的結合降低的D2E7變體。本發(fā)明提供具有 與D2E7的CDR序列相關的CDR序列的抗TNF-a抗體，但其具有至少一個降低與抗Id抗體 的結合的取代。所述變體在本文中有時稱作"降低免疫原性"變體。
[0012] 本發(fā)明的抗TNF-a抗體包含6個氨基酸序列對應于W下序列的CDR;SEQID N0:5(CDR-Hl)、WQIDN0:6(CDR-ffi)、WQIDN0:7(CDIM13)、WQIDN0:8(CDR-Ll)、WQ IDN0:9(CDR-L2)和SEQIDN0:10(CDR-冊），并且具有至少一個選自W下的取代；CDR-Ll 中的G5F、CDR-L1 中的G5I、CDR-L1 中的G5V、CDR-L1 中的G5W、CDR-L1 中的G5Y、CDR-L1 中 的R7I、CDR-L1 中的R7T、CDR-L1 中的R7V、CDR-L1 中的N8A、CDR-L1 中的N8D、CDR-L1 中 的N8E、CDR-L1 中的N8G、CDR-L1 中的N8L、CDR-L1 中的N8M、CDR-L1 中的N8Q、CDR-L1 中 的N8R、CDR-L1 中的N8T、CDR-L2 中的All、CDR-L2 中的A1T、CDR-L2 中的A1V、CDR-L2 中 的T4D、CDR-L3 中的R2G、CDR-L3 中的MF、CDR-L3 中的N4M、CDR-L3 中的N4W、CDR-L3 中 的MY、CDR-L3中的貼L、CDR-L3中的貼N、CDR-L3中的貼W、CDR-L3中的貼Y、CDR-L3中 的T9Y、CDR-H1 中的D1S、CDR-H1 中的Y2A、CDR-H1 中的Y2C、CDR-H1 中的Y2K、CDR-H1 中 的Y2M、CDR-H1 中的Y2R、CDR-H1 中的Y2S、CDR-H1 中的Y2V、CDR-H1 中的冊C、CDR-H1 中 的冊D、CDR-H1中的冊E、CDR-H1中的冊S、CDR-H1中的冊T、CDR-肥中的T3A、CDR-肥中 的T3G、CDR-肥中的T3N、CDR-肥中的W4A、CDR-肥中的W4F、CDR-肥中的W4H、CDR-肥中 的W4L、CDR-肥中的W4M、CDR-肥中的W4V、CDR-肥中的N5G、CDR-肥中的S6D、CDR-肥中的 S化、CDR-肥中的I9K、CDR-肥中的D10L、CDR-肥中的Y11A、CDR-肥中的Y11C、CDR-肥中 的Y11EXDR-肥中的Y11FXDR-肥中的Y11GXDR-肥中的Y11HXDR-肥中的Y11IXDR-肥 中的YUK、CDR-H2 中的Y11L、CDR-H2 中的Y11M、CDR-H2 中的Y11N、CDR-H2 中的Y11Q、 CDR-H2 中的Y11R、CDR-H2 中的Y11S、CDR-H2 中的Y11V、CDR-H2 中的Y11W、CDR-H2 中的 A12YXDR-H2 中的D13NXDR-H2 中的V15DXDR-H2 中的V15UCDR-H2 中的V15MXDR-H2 中 的V15QXDR-肥中的V15TXDR-肥中的E16FXDR-肥中的E16HXDR-肥中的E16KXDR-肥 中的E16R、CDR-H2 中的E16T、CDR-H2 中的E16W、CDR-H2 中的G17A、CDR-H2 中的G17C、 CDR-H2 中的G17E、CDR-H2 中的G17H、CDR-H2 中的G17I、CDR-H2 中的G17K、CDR-H2 中的 G17UCDR-H2 中的G17MXDR-H2 中的G17NXDR-H2 中的G17PXDR-H2 中的G17QXDR-H2 中 的G17R、CDR-肥中的G17S、CDR-肥中的G17T、CDR-肥中的G17Y、CDR-冊中的V1G、CDR-冊 中的V1R、CDR-H3 中的V1W、CDR-H3 中的L4T、CDR-H3 中的L4V、CDR-H3 中的T6V、CDR-H3 中 的S9KXDR-冊中的S9WXDR-冊中的S9Y和CDR-冊中的D11V。與阿達木單抗的CDR序列 相比，6個CDR總共可具有至多8個、至多7個、至多6個、至多5個或至多4個氨基酸取代。 在某些方面中，與阿達木單抗的CDR相比，各CDR可具有至多4個、至多3個或至多2個取 代。在具體實施例中，本發(fā)明的抗TNF-a抗體具有氨基酸取代的一或多個組合，其中重鏈 取代（如果存在）包含W下中的至少一者；(a)CDR-Hl中的Y2K;(b)CDR-Hl中的Y2M;(c)CDR-H1中的Y2K和CDR-冊中的T6V; (d)CDR-H1中的Y2KXDR-冊中的V1G和CDR-冊中的 T6V;(e)CDR-冊中的V1W;和（f)CDR-冊中的V1G和CDR-冊中的T6V，并且其中輕鏈取代 (如果存在）包含W下中的至少一者；（a)CDR-L1中的G5S和CDR-L1中的A11S;化)CDR-L1 中的R7I; (C)CDR-L1 中的G5S、CDR-L1 中的R7T和CDR-L1 中的Alls;和（d)CDR-L1 中的 G5SXDR-L1中的R7I和CDR-L1中的Alls。在具體實施例中，本發(fā)明抗體包含選自圖22中 所述氨基酸取代的氨基酸取代的組合。
[0013] 本發(fā)明的抗TNF-a抗體優(yōu)選與阿達木單抗抗個體基因型抗體5A1、10F8、7A11、 mil、6All和10B7中的一者、二者、H者、四者、五者或所有六者的結合降低。
[0014] 本發(fā)明進一步涉及編碼本發(fā)明的抗TNF-a抗體的核酸分子和包含其的宿主細 胞。
[0015] 本發(fā)明進一步涉及包含本發(fā)明的抗TNF-a抗體的醫(yī)藥組合物和通過投與抗 TNF-a抗體或含有其的醫(yī)藥組合物治療患有免疫病癥的人類患者的方法。在某些方面中， 所治療免疫病癥是類風濕性關節(jié)炎（RA)(包括成人的中度到嚴重RA)、青少年型特發(fā)性關 節(jié)炎（JIA)(包括4歲和更大年齡患者的中度到嚴重多關節(jié)JIA)、銀屑病關節(jié)炎（PsA)(包 括成人的PsA)、關節(jié)粘連性脊椎炎（A巧（包括成人的AS)、克羅恩氏病把rohn'sdisease) (CD)(包括成人的中等或嚴重CD)、慢性斑塊狀銀屑病（Ps)(包括成人的中度到嚴重慢性斑 塊狀銀屑?。┗蜉S也型脊椎關節(jié)炎（axSpA)(包括無結構損害的X射線證據(jù)的成人患者的 嚴重axSpA)。
【附圖說明】
[0016] 圖1A-1C;圖1A提供合成D2E7 (阿達木單抗，HUMIRA)可變重鏈（Vh)和可變輕鏈 (V^片段的翻譯氨基酸序列。圖1B提供0267￥?和V^片段的CDR氨基酸序列。圖1C提供 D2E7Vh和D2E7Vl片段的核巧酸序列（分別為SEQIDN0:1和SEQIDN0:3)。
[0017] 圖2 ;提供D2E7-Vl中引起與TNF-a的中性結合和與抗Id5Al(a)、10F8(b)或 7All(c)的降低結合的有益突變列表。給出在個別CDR和在卡己特化abat)編號兩種情況 下的氨基酸位置。圖2按出現(xiàn)順序分別掲示SEQIDNO. :8-10。
[001引 圖3A-3B;圖3A提供D2E7-VhCDR-H1和CDR-肥中將引起與TNF-a的中性 結合和與抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7(f)的降低結合的有益突變列表。圖3B提供 D2E7-VhCDR-H3中引起與TNF-a的中性結合和與抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7訊的降 低結合的有益突變列表。給出在個別CDR和在卡己特編號兩種情況下的氨基酸位置。圖3A 按出現(xiàn)順序分別掲示SEQIDNO. :5-6。圖3B掲示SEQIDN0:7。
[0019] 圖4提供載體pYA206和pCWeOO中的D2E7的結構。
[0020] 圖5提供人類TNF-a對細胞表面表達的WTD2E7F油的滴定曲線。
[0021] 圖6提供結合到細胞表面表達的WT-D2E7F油的抗個體基因型（抗Id)的滴定曲 線。
[0022] 圖7A-7B;圖7A提供經(jīng)TNF-a染色的野生型D2E7的FACS分選概況。圖7B提供 經(jīng)TNF-a染色的Vh點突變庫的FACS分選概況。
[002引圖8A-8B提供經(jīng)1H11染色的野生型D2E7和Vh點突變庫的FACS分選概況。
[0024] 圖9提供沉默密碼子突變D2E7富集比（W位置計）。給出在個別CDR情況下的氨 基酸位置。
[0025] 圖10提供D2E7子庫的板圖。給出在個別CDR和在卡己特編號兩種情況下的氨基 酸位置。圖10按出現(xiàn)順序從頂部到底部，從左到右分別掲示SEQIDNO. :8-10和5-7。
[0026] 圖11提供D2E7突變體子庫和野生型對照的FACS概況。
[0027] 圖12提供D2E7突變體子庫和野生型對照的FACS概況。
[002引圖13A-13D提供D2E7重鏈可變區(qū)的空間填充模型。圖A、B和C分別W灰色顯示 輕鏈CDR1、2和3。圖DW灰色顯示抗Id抗Id1H11的表位。如下文所繪示Vh序列（SEQ IDN0:2)顯示加下劃線的CDR和W粗體雙下劃線文本表示的對于與抗Id1H11的結合重要 的位置。H個CDR中的各者都向所述表位貢獻一或多個氨基酸。
[0029] EVQLVESGGGLVQPGR化化SCAASGFT抑ax:晝旦'WVRQAPGKGLEWVSAIT巡NSGHIDYADS 哩^RFTIS畑NAKNSLYLQMN化RAEDTAVYYCAK里進 ^STASSLDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO: 2)
[0030] 圖14A-14D提供D2E7輕鏈可變區(qū)的空間填充模型。圖A、B和C分別W灰色顯示 輕鏈CDR1、2和3。圖DW灰色顯示抗Id5A1和10F8的表位。如下文所繪示列（SEQ IDN0:4)顯示加下劃線的CDR和W粗體雙下劃線文本表示的對于與抗Id5A1和10F8的結 合重要的位置。H個CDR中的各者都向所述表位貢獻一或多個氨基酸。
[0031] DIQMTQSPS化SASVGDRVTITCRASQGIRNYI,AWYQQKPGKAPKU,TYAASIIQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTIS化QP邸VATYYC皿I狂RAPYTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:4)
[003引 圖15提供D2E7-VhCDRl-2突變體的單點FACS分析。
[0033] 圖16提供D2E7代表性位置分析。
[0034] 圖17提供平均1H11富集比（W位置計）。
[0035] 圖18提供平均5A1富集比（W位置計）。
[0036] 圖19提供平均10F8富集比（W位置計）。
[0037] 圖20A-20B顯示抗TNF-a抗體突變對與四個市售供體的血清試樣中的抗阿達木 單抗抗體的結合的影響。氨基酸位置是W卡己特編號給出。VkSS是指CDR-L1中具有取代 G28S和A34S(卡己特編號）的化，其對應于CDR-L1中的G5S+A11S組合。
[0038] 圖21A-21B顯示與抗阿達木單抗抗體的結合的降低最大的抗TNF-a變體抗體。 VkSS是指CDR-L1中具有取代G28S和A34S(卡己特編號）的化，其對應于CDR-L1中的 G5S+A11S組合。
[0039] 圖22顯示具有多個氨基酸取代的變體的結合數(shù)據(jù)。VkSS是指CDR-L1中具有取 代G28S和A34S(卡己特編號）的化，其對應于CDR-L1中的G5S+A11S組合。
【具體實施方式】
[0040] 識別具有陳化免疫原巧的杭體的方法
[0041] 本發(fā)明進一步提供允許對要闡明的所關注抗體（參考抗體）內(nèi)所關注區(qū)域中的每 一氨基酸的免疫原性貢獻的系統(tǒng)。所述方法需要對參考抗體在一或多個區(qū)（例如，CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-肥、CDR-冊、FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-H1、FR-肥、FR-冊和 FR-H4中的一或多者）進行全面誘變和評估突變對與抗個體基因型抗體（"抗Id")的結合 的效應。本文所述方法可識別上述具有降低免疫原性的抗TNF-a抗體變體。
[0042]庫設計和構筑:設計抗體庫，其在參考抗體的所需區(qū)或結構域中的每一可能位置 處含有每一可能單一氨基酸取代，用于識別突變對與抗Id抗體的結合的效應（良好、差或 中性）。隨后使用（例如）"隨機化NNK密碼子"構筑抗體變體庫W產(chǎn)生單一氨基酸變體， 其中"N"是指任何堿基（例如，A、C、G或T)且"K"是指G或T。NNK隨機化方案可編碼覆 蓋所有20種天然氨基酸的32個不同密碼子?？贵w的各位置處的氨基酸殘基可突變?yōu)榕c 相同位置處的野生型氨基酸不同的19種氨基酸中的任一者，從而在抗體中產(chǎn)生單一氨基 酸點突變。最終結果是抗體變體庫，其涵蓋有一個殘基在庫中成員之間各有不同的多種抗 體的群組。基于祀向突變的氨基酸數(shù)目，庫的總體復雜性可介于約50-10, 000個成員之間 (例如，50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、 7000、7500、8000、8500、9000、9500 或 10, 000 個成員），介于約 1000-5000 個成員之間，或為 約1000個成員。與庫的大小和復雜性無關，本文所述方法容許同時篩選庫的所有成員并同 時對其進行測序。
[0043] 作為非限制性實例，為識別與參考抗體相比具有降低免疫原性的特定抗體變體， 互補決定區(qū)（CDR)中的氨基酸殘基是潛在突變祀。B細胞表位的消除或減少可產(chǎn)生具有降 低免疫原性的抗體。通常，可考慮并識別約50到60個CDR氨基酸位置用于突變?？稍O計 并構筑合成DNA片段組，其編碼野生型親代Vh或V許日所有可能的單一氨基酸抗體變體?？?使用上述隨機化NNK密碼子產(chǎn)生單一氨基酸抗體變體。因此，CDR內(nèi)各位置處的氨基酸殘 基可突變，從而沿所選CDR區(qū)產(chǎn)生單一氨基酸點突變。最終結果是抗體變體庫，其是有一個 殘基在庫中成員之間各有不同的多種抗體的群組。在此實例中，庫具有約1000-1300個成 員，其中所選區(qū)中的50到60或65個CDR氨基酸位置中的各者經(jīng)19種天然氨基酸中的一 者取代，在任何給定位置處總共20種不同氨基酸（即，50X20 = 1000 ;60X20 = 1200 ;或 65X20 = 1300)。
[0044]抗體變體的表達;在庫構筑后，第二步驟是表達抗體變體庫用于通過細胞表面展 示來分選。可使用基于展示的方法（例如瞻菌體展示、酵母展示、細菌展示和核糖體展示） 表達變體庫，并且優(yōu)選地在哺乳動物細胞中表達W確保所表達變體進行適當折疊和翻譯后 修飾。
[0045] 對于哺乳動物表達來說，用于在細胞表面上系留并展示四聚體免疫球蛋白分子的 跨膜結構域可為能夠經(jīng)由酶、化學或光解裂解移除的任何跨膜結構域。在一些實施例中， 跨膜結構域側接由裂解酶鑒別并裂解的裂解位點。舉例來說，裂解酶可為脂肪酶、醋酶、磯 酸酶、糖巧酶或駿膚酶。在一些實施例中，跨膜結構域包含具有核酸酶（例如核糖核酸酶 (RNase)或脫氧核糖核酸酶值化se))鑒別并裂解的序列的寡核巧酸或寡核巧酸類似物。在 一些實施例中，跨膜結構域包含蛋白酶鑒別并裂解的膚或膚類似物。
[0046] 在一些實施例中，可使用mRNA剪接產(chǎn)生具有或無跨膜結構域的免疫球蛋白（例 女口，參見美國專利第7, 947, 495號，其全部內(nèi)容都W引用方式并入本文中）。
[0047] 在其它實施例中，跨膜結構域側接由重組酶鑒別的重組酶鑒別位點。重組酶鑒 別位點的實例包括（但不限于）lox位點、att位點、dif位點和化t位點。關于重組酶的 綜述參見（例如）索爾（Sauer) ,1994,生物技術新見（Qirr.Opin.Biotech.) 5:521-527; 蘭迪（Landy)，1993,生物技術新見 3:699-707 ;薩多夫斯基（Sadowski)，1993,FASEB 7:760-767 ;和美國專利公開案第20040115814號。
[0048] 用于本文所述組合物和方法中的跨膜結構域可源自I型、II型和III型 膜蛋白（例如，參見切斯納特（Chesnut)等人，1996,免疫學方法雜志（J.Imm. Methods)，193:17-27 ;瓦爾貝里（W址化erg)等人，1997,細胞生物學雜志（J.Cell Biol. )，137:555-562;廖（Liao) ,2001，生物技術與生物工程炬iotech.and Bioeng. )，73:313-323 ;和美國專利第5, 264,