針對(duì)賦予膦絲菌素-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的酶的單克隆抗體及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】針對(duì)賦予麟竺菌素-N-乙醜轉(zhuǎn)移酶抗性的酶的單克隆抗體 及檢測(cè)方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求獲得于2012年10月10日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)61/711，950的 權(quán)益。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及的領(lǐng)域是應(yīng)用于旨在檢測(cè)由某些轉(zhuǎn)基因植物事件表達(dá)的酶的 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）的免疫學(xué)，該些酶可賦予對(duì)草錠麟，即k麟絲菌素除草劑的 抗性。
[0004] 背景
[0005] 編碼麟絲菌素-N-己酷轉(zhuǎn)移酶（PAT)巧0 2.3. 1. 183)的基因常規(guī)地用作植物 轉(zhuǎn)基因事件的可選擇標(biāo)記，它們最初是從常見(jiàn)的好氧上壤放線菌一一綠色產(chǎn)色鏈霉菌 (Streptomycesviridoc虹omogenes)中分離的。PAT酶催化麟絲菌素的己酷化，將其脫毒 為無(wú)活性的化合物，導(dǎo)致氨積累和細(xì)胞死亡（MurakamiT.，AnzaiH.，ImaiS.，SatohA.， P'JagaokaK.，ThompsonC.J. (1986).MolGenGenet205:42-50;TwellD.，KleinT.M.， 化ommM.E.，McCormickS. (1989).Plant化ysiol91 ; 1270-1274.)。因此，表達(dá)PAT的轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞能夠用草錠麟加W選擇。
[0006] 開(kāi)發(fā)并銷(xiāo)售用于播種用種子產(chǎn)品（plantingseedpro化cts)的重組DNA性狀 (traits)的公司制訂、執(zhí)行并遵守嚴(yán)格的產(chǎn)品管理計(jì)劃。該些管理計(jì)劃要求對(duì)重組性狀的 各種組分使用經(jīng)驗(yàn)證的定量和定性蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，W跟蹤性狀滲入和種子產(chǎn)生活性，W 及監(jiān)測(cè)谷物收成。該些檢測(cè)方法必須足夠容易使用并且足夠魯椿，W供在GLP和非GLP條 件下使用。此外，該些方法必須對(duì)用戶足夠友好，W使農(nóng)民便于在田間、糧商便于在筒倉(cāng)、海 關(guān)官員便于在邊境使用。因此，魯椿、高質(zhì)量、用戶友好的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法和商業(yè)試劑盒是 有用的且必要的。
[0007] 盡管化ISA在本領(lǐng)域眾所周知，但是開(kāi)發(fā)能夠在實(shí)驗(yàn)室和田間設(shè)置下重復(fù)檢測(cè)一 系列植物組織中的特定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的魯椿、高質(zhì)量、經(jīng)驗(yàn)證的（validatecOELISA方法既不 是瑣碎小事，亦非常規(guī)手段。更具有挑戰(zhàn)性的是發(fā)現(xiàn)特別適合于開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)功能性PAT 轉(zhuǎn)基因事件的側(cè)向流試紙條（lateralflowstrip)和/或化ISA的抗體對(duì)（antibody pairs)。 發(fā)明概要
[0008] 本發(fā)明提供了一組單克隆抗體（mAbs)，155AD4，15祀2. 1. 114，15593，155912，和 155Q19. 1，和產(chǎn)生該些mAbs的雜交瘤細(xì)胞系。該些mAbs令人驚訝地非常適用于檢測(cè)多種 植物和植物組織中表達(dá)PAT的轉(zhuǎn)基因事件。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用本發(fā)明免疫球蛋白的 定量和定性免疫測(cè)定法，并且一般性地包括用于鑒定PAT酶存在的方法，其包括a)將第一 種要求保護(hù)的mAb固定在測(cè)定表面上，然后清洗所述測(cè)定表面；b)使所述測(cè)定表面與懷疑 含有PAT的液體接觸足W容許結(jié)合的一段時(shí)間，然后清洗所述測(cè)定表面；c)使所述測(cè)定表 面與和報(bào)告基團(tuán)綴合的不同的要求保護(hù)的第二種抗體接觸一段時(shí)間，該接觸時(shí)間足W容許 所述第二種綴合單克隆抗體結(jié)合，然后清洗所述測(cè)定表面；和d)檢測(cè)所述報(bào)告基團(tuán)的存在 或不存在。本發(fā)明進(jìn)一步一般性地包括用于定量測(cè)定PAT酶的方法，包括；a)將PAT特異性 單克隆抗體固定在測(cè)定表面上；b)使所述測(cè)定表面與懷疑含有PAT的液體接觸足W容許結(jié) 合的一段時(shí)間，然后清洗所述測(cè)定表面；C)使所述測(cè)定表面與和報(bào)告基團(tuán)綴合的不同的要 求保護(hù)的第二抗體接觸一段時(shí)間，該接觸時(shí)間足W容許所述第二綴合單克隆抗體結(jié)合，然 后清洗所述測(cè)定表面；和d)通過(guò)從比較到校準(zhǔn)曲線插值來(lái)定量所述報(bào)告基團(tuán)的存在。本發(fā) 明還包括使用該些mAbs分離或檢測(cè)PAT的方法，包括；a)將所述抗體固定化到表面上；b) 使所述固定化的抗體與含有PAT的混合物接觸；C)從所述混合物中分離與PAT結(jié)合的所述 固定化抗體；和d)通過(guò)從所述固定化抗體中移出與抗體結(jié)合的PAT來(lái)回收PAT。
[0009] 附圖簡(jiǎn)述
[0010] 圖1是化ISA標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。純化的重組PAT蛋白被稀釋成7個(gè)濃度，范圍是 0. 25-6.Ong/mL。使用450nm的光密度讀數(shù)減去650nm的背景OD對(duì)濃度進(jìn)行描點(diǎn)繪圖。
[0011] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0012] 本發(fā)明包括特異性結(jié)合PAT的抗體和產(chǎn)生該些mAbs的雜交瘤。下表列出了要求 保護(hù)的雜交瘤細(xì)胞系命名及其相應(yīng)的保藏日期。
[001 引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異性結(jié)合膦絲菌素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT)的單克隆抗體，其選自下列單克隆 抗體的組：155AD4, 155E2.L114, 155Q3, 155Q12,和 155Q19. 1。
2. 權(quán)利要求1的單克隆抗體，由命名為155AD4的雜交瘤產(chǎn)生。
3. 權(quán)利要求1的單克隆抗體，由命名為155E2. 1. 114的雜交瘤產(chǎn)生。
4. 權(quán)利要求1的單克隆抗體，由命名為155Q3的雜交瘤產(chǎn)生。
5. 權(quán)利要求1的單克隆抗體，由命名為155Q12的雜交瘤產(chǎn)生。
6. 權(quán)利要求1的單克隆抗體，由命名為155Q19. 1的雜交瘤產(chǎn)生。
7. -種產(chǎn)生權(quán)利要求1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其以選自下組的登錄號(hào)保藏 在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC) :PTA-13186，PTA-13187，PTA-13188，PTA-13189,和 PTA-13190。
8. 權(quán)利要求7的雜交瘤，其以ATCC登錄號(hào)PTA-13186保藏。
9. 權(quán)利要求7的雜交瘤，其以ATCC登錄號(hào)PTA-13187保藏。
10. 權(quán)利要求7的雜交瘤，其以ATCC登錄號(hào)PTA-13188保藏。
11. 權(quán)利要求7的雜交瘤，其以ATCC登錄號(hào)PTA-13189保藏。
12. 權(quán)利要求7的雜交瘤，其以ATCC登錄號(hào)PTA-13190保藏。
13. -種用于鑒定PAT酶的存在的方法，包括： a) 將第一種權(quán)利要求1的單克隆抗體固定到測(cè)定表面上，然后清洗所述測(cè)定表面； b) 使所述測(cè)定表面與懷疑含有PAT的液體接觸足以容許結(jié)合的一段時(shí)間，然后清洗所 述測(cè)定表面； c) 使所述測(cè)定表面與和報(bào)告基團(tuán)綴合的不同的第二種權(quán)利要求1的抗體接觸足以容 許所述第二種綴合單克隆抗體結(jié)合的一段時(shí)間，然后清洗所述測(cè)定表面；和 d) 檢測(cè)所述報(bào)告基團(tuán)的存在或不存在。
14. 一種用于定量測(cè)定PAT酶的方法，包括： a) 將PAT多克隆抗體固定到測(cè)定表面上； b) 使所述測(cè)定表面與懷疑含有PAT的液體接觸足以容許結(jié)合的一段時(shí)間，然后清洗所 述測(cè)定表面； c) 使所述測(cè)定表面與和報(bào)告基團(tuán)綴合的不同的第二種權(quán)利要求1的抗體接觸足以容 許所述第二種綴合單克隆抗體結(jié)合的一段時(shí)間，然后清洗所述測(cè)定表面；和 d) 通過(guò)從校準(zhǔn)曲線插值來(lái)定量所述報(bào)告基團(tuán)的存在。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述綴合單克隆抗體選自155Q12和155Q19. 1。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述綴合單克隆抗體是155Q12。
17. 權(quán)利要求14的方法，其中所述綴合單克隆抗體是155Q19. 1。
【專(zhuān)利摘要】本文描述了用于確定和定量膦絲菌素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin-N-acetyl-transferase)存在的單克隆抗體和方法。權(quán)利要求的抗體和方法特別用于確定和定量在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的膦絲菌素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在。PTA-1318620120912 PTA-1319020120912 PTA-1318920120912 PTA-1318820120912 PTA-1318720120912
【IPC分類(lèi)】G01N33-573, C12N5-12, C07K16-40
【公開(kāi)號(hào)】CN104704003
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380052572
【發(fā)明人】G·單, E·H·馬
【申請(qǐng)人】美國(guó)陶氏益農(nóng)公司
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年10月9日
【公告號(hào)】CA2886673A1, EP2906600A1, US20140099650, WO2014059002A1