包含兩個(gè)Fab片段的無(wú)Fc的抗體及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及包含至少兩個(gè)F油片段的雙特異性抗體，其中第一F油片段包含對(duì)第 一抗原特異的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且第二Fab片段包含對(duì)第二抗原特異的至少一個(gè) 抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中將第二Fab重鏈和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)交換；并且兩個(gè)Fab片段通過(guò) 兩個(gè)膚接頭彼此連接，并且其中所述雙特異性抗體缺少化結(jié)構(gòu)域；設(shè)及用于產(chǎn)生它們的方 法，設(shè)及含有所述抗體的藥物組合物和其用途。
[0002] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及特異性結(jié)合T細(xì)胞活化抗原和腫瘤抗原（TA)的雙特異性抗體， 其包含第一F油片段和第二F油片段，其中將第二F油重鏈和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)交換 和兩個(gè)Fab片段通過(guò)兩個(gè)膚接頭彼此連接；并且其中雙特異性抗體不包含化結(jié)構(gòu)域；用于 產(chǎn)生它們的方法、含有所述抗體的藥物組合物和其用途。
[000引背景
[0004] 單克隆抗體（mAb)是一類(lèi)日益重要的治療劑。除由全尺寸形式的IgG組成 的mAb產(chǎn)物之外，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了類(lèi)型廣泛的多特異性重組抗體樣式，例如由如IgG抗 體樣式與單鏈結(jié)構(gòu)域融合的四價(jià)雙特異性抗體（見(jiàn)例如Coloma,M.J.等人，化ture Biotech15 (1997) 159-163 ;W0 2001/077342;和Morrison,S.L.,NatureBiotech 25(2007) 1233-1234)。
[000引已經(jīng)開(kāi)發(fā)了其中不再留下抗體核巧結(jié)構(gòu)（IgA、I曲、I班、IgG或IgM)的幾種其他 新樣式如雙體、=體或四體抗體、微型抗體，能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的幾種單鏈形式 (scFv、雙scFvHHolliger,P.等人，化1:山"6 Biotech23(2005) 1126-1136;Fischer,N.,Le ger,0. ,Pathobiology74 (2007) 3-14;Shen, J.等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74;Wu，C.等人，化Uire Biotech.25(2007) 1290-1297)。
[0006] 全部該類(lèi)樣式均使用接頭W使抗體核巧（IgA、I曲、I班、IgG或IgM)與其他結(jié)合 蛋白（例如scFv)融合或W使例如兩個(gè)F油片段或scFv融合（Fischer,N. ,L6ger, 0. ,Pa thobiology74(2007)3-14)。串聯(lián)scFV是通過(guò)額外膚接頭連接的兩個(gè)scFv片段并且也 稱(chēng)作（scFv)2。通過(guò)減小可變結(jié)構(gòu)域之間膚接頭的長(zhǎng)度，產(chǎn)生雙體抗體（di油ody)。在兩 種多膚之間添加額外膚接頭產(chǎn)生了所謂的單鏈雙體抗體。US2007/0274985設(shè)及包含單鏈 Fab(scFab)片段的抗體。與全尺寸單克隆抗體相比，抗體片段作為治療劑具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)： 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它們更小并且更快地進(jìn)入組織和腫瘤。此外，已經(jīng)提出小尺寸的片段允許與 全尺寸單克隆抗體不可及的表位結(jié)合。缺點(diǎn)在于，片段在人類(lèi)中顯示短循環(huán)半壽期，該可能 歸因于腎清除。較短半壽期可能妨礙治療劑在祀向的部位充分積累?？贵w片段的產(chǎn)生并不 繁瑣，因?yàn)槠慰赡苄纬删奂锊⑶铱赡鼙热叽鐔慰寺】贵w不穩(wěn)定。此外，非相關(guān)重鏈和 輕鏈的不想要配對(duì)導(dǎo)致無(wú)活性抗原結(jié)合位點(diǎn)和/或其他無(wú)功能的不想要的副產(chǎn)物的形成， 該在臨床規(guī)模生產(chǎn)和治療性應(yīng)用抗體片段中是主要問(wèn)題。具體而言，其中兩個(gè)或更多個(gè)Fab 借助一種連接物彼此融合的串聯(lián)-Fab構(gòu)建體不是可行的，原因在于兩條輕鏈的隨機(jī)締合 產(chǎn)生無(wú)活性、不想要的副產(chǎn)物。該些缺點(diǎn)現(xiàn)在已經(jīng)用本發(fā)明的新抗體樣式克服。本文中提 供一種新的雙特異性抗體樣式，所述雙特異性抗體樣式可W因錯(cuò)配副產(chǎn)物的量減少而W增 加的產(chǎn)率容易地產(chǎn)生，比本領(lǐng)域已知的雙特異性抗體片段顯示更少聚集。使用交換方案糾 正LC締合可W在不需要產(chǎn)生共有輕鏈的情況下實(shí)現(xiàn)。常規(guī)的輕鏈法不可能用于現(xiàn)存的抗 體。進(jìn)一步，新的雙特異性抗體樣式是穩(wěn)定的并且在比現(xiàn)存雙特異性樣式更高的溫度不聚 集，該允許更好的生產(chǎn)性和可發(fā)展性。此外，與許多常規(guī)雙特異性抗體片段相比，該種新的 雙特異性抗體樣式具有更高的分子量，因此防止過(guò)度腎清除并導(dǎo)致改進(jìn)的體內(nèi)半壽期。新 的雙特異性抗體樣式具有完整功能并且具有與相應(yīng)的常規(guī)雙特異性抗體可比較的或改進(jìn) 的結(jié)合作用和活性。
[0007] 在多種臨床環(huán)境下經(jīng)常希望選擇性破壞單個(gè)細(xì)胞或特定細(xì)胞類(lèi)型。例如，它是特 異性摧毀腫瘤細(xì)胞，同時(shí)留下健康細(xì)胞和組織不受損害的癌療法的主要目的。一個(gè)方案是 選擇性地誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)引起免疫效應(yīng)細(xì)胞如天然殺傷（NK)細(xì) 胞或細(xì)胞毒T淋己細(xì)胞（CTLs)攻擊并隨后破壞腫瘤細(xì)胞。CTL構(gòu)成免疫系統(tǒng)的最強(qiáng)有力 效應(yīng)細(xì)胞，然而它們不能由常規(guī)治療性抗體化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞機(jī)制活化。在該個(gè)方 面，能夠與癌細(xì)胞上的表面抗原結(jié)合并能夠結(jié)合至T細(xì)胞受體（TCR)復(fù)合物的不變活化組 分的雙特異性抗體近幾年已經(jīng)變得有意義。雙特異性抗體與其兩種祀同時(shí)結(jié)合迫使癌細(xì)胞 和T細(xì)胞之間短暫相互作用，造成細(xì)胞毒T細(xì)胞活化和隨后腫瘤細(xì)胞裂解。
[000引已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種雙特異性抗體樣式并且研究了它們對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療 法的適用性。該些抗體樣式當(dāng)中，已經(jīng)非常充分地表征了所謂的BiTE(雙特異性T細(xì)胞 銜接體化ispecificTcellengager))分子并且它們已經(jīng)在臨床上顯示一些有前景的 結(jié)果（綜述見(jiàn)Nagorsen和Bauerle,ExpCellRes317,1255-1260(2011))。BiTE是其 中兩個(gè)scFv分子通過(guò)柔性接頭融合的串聯(lián)scFv分子。被評(píng)價(jià)T細(xì)胞銜接作用的其他雙 特異性樣式包括雙體抗體（di油ody)(Holliger等人，ProtE；ng9,299-305(1996))及 它們的衍生物，如串聯(lián)雙體抗體化ipriyanov等人，JMolBiol293,41-66(1999))。更 近的發(fā)展是所謂的DART(雙親和力再定向（化alaffinityretargeting))分子，其是基 于雙體抗體樣式，但是W起到額外穩(wěn)定作用的C末端二硫鍵為特征（Moore等人，Blood 117, 4542-51 (2011))。所謂的S功能抗體（triomabs)，其是完整雜合小鼠/大鼠IgG分子 并且目前還在臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)，代表一種較大尺寸的樣式（綜述見(jiàn)Seimetz等人，Cancer TreatRev36,458-467(2010))0
[0009] 但是，迄今已知為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法所開(kāi)發(fā)的雙特異性抗體具有設(shè)及其 有效性、毒性和適用性的主要缺點(diǎn)。小構(gòu)建體例如BiTE分子雖然能夠有效地交聯(lián)效應(yīng)細(xì)胞 和祀細(xì)胞，但具有非常短的血清半壽期，需要將它們通過(guò)連續(xù)輸注施用至患者。在另一方 面，IgG樣樣式雖然具有半壽期長(zhǎng)的巨大益處，但遭遇與IgG分子內(nèi)在的天然效應(yīng)子功能相 關(guān)的毒性。對(duì)于成功的治療性開(kāi)發(fā)而言，該種免疫原性潛力構(gòu)成IgG樣雙特異性抗體的另 一個(gè)不利特征。最后，在雙特異性抗體的一般開(kāi)發(fā)中的一個(gè)主要難題是W臨床上足夠的量 和純度產(chǎn)生雙特異性抗體構(gòu)建體。共表達(dá)時(shí)不同特異性的抗體重鏈和輕鏈的錯(cuò)誤配對(duì)減少 正確裝配的構(gòu)建體的產(chǎn)生并導(dǎo)致許多無(wú)功能的副產(chǎn)物。
[0010] 鑒于與目前可用于T細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法的雙特異性抗體相關(guān)的難題和缺 點(diǎn)，仍需要該類(lèi)分子的新穎改進(jìn)樣式?，F(xiàn)在已經(jīng)用本發(fā)明的新雙特異性抗體克服了該些缺 點(diǎn)。新的雙特異性抗體能夠容易地產(chǎn)生，同時(shí)由于錯(cuò)配副產(chǎn)物的量減少而增加了新的雙特 異性抗體的產(chǎn)量，所述抗體比本領(lǐng)域已知的雙特異性抗體片段顯示更少聚集。此外，與本領(lǐng) 域已知的雙特異性抗體樣式相比，新的雙特異性抗體在增加的溫度是穩(wěn)定的。使用交換方 案能夠?qū)嵤┱_的鏈締合且不需要產(chǎn)生共有輕鏈。此外，與許多常規(guī)雙特異性抗體片段相 比，新的雙特異性抗體具有較高的分子量，因此防止過(guò)度腎清除并導(dǎo)致改進(jìn)的體內(nèi)半壽期。 進(jìn)一步地，僅需要兩種質(zhì)粒W產(chǎn)生新的雙特異性抗體。新的雙特異性抗體具有完整功能并 且具有與相應(yīng)的常規(guī)雙特異性抗體可比較的或改進(jìn)的結(jié)合作用和活性。
[0011] 本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)用于T細(xì)胞活化和再定向的雙特異性抗原結(jié)合分子，所述雙特 異性抗原結(jié)合分子組合了良好的有效性和可生產(chǎn)性及低毒性和有利藥代動(dòng)力學(xué)特性。
[0012] 概述
[0013] 本發(fā)明設(shè)及包含至少兩個(gè)F油片段的雙特異性抗體，其中第一F油片段包含對(duì)第 一抗原特異的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且第二Fab片段包含對(duì)第二抗原特異的至少一個(gè) 抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中將第二Fab重鏈和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)交換；并且兩個(gè)Fab片段通過(guò) 兩個(gè)膚接頭彼此連接，并且其中所述雙特異性抗體缺少化結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述膚接頭是 佑4。2接頭。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體額外地包含第=F油片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述第=F油片段包含對(duì)第一或第二抗原特異、優(yōu)選地對(duì)第一抗原特異的至少一個(gè)抗原結(jié)合 位點(diǎn)。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，