一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種源于帶魚魚肉蛋白鐵螯合肽及其制備方法，屬于水產(chǎn)品精深加工技術領域。
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【背景技術】
[0003]生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽類，是當前藥物及保健品研宄的熱點。目前，通過蛋白酶解生產(chǎn)的活性肽主要來源于陸地的蛋白源，海洋生物生存環(huán)境明顯區(qū)別于陸地環(huán)境，其蛋白質的氨基酸組成或序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，在種類和數(shù)量上也遠遠超過陸源蛋白資源。因此，借鑒陸地活性肽開發(fā)的酶工程技術，以海洋生物蛋白資源為原料，通過對制備工藝的綜合研宄，將研制出陸地蛋白源和化學合成所無法生產(chǎn)的系列天然、高效、新穎的生物活性肽。
[0004]鐵是人類的必須的微量元素，對嬰幼兒和兒童的生長發(fā)育至關重要。大分子蛋白質雖然也可以與鐵離子結合，但鐵螯合蛋白質分子量大，難以通過腸黏膜，不利于鐵離子的吸收。而現(xiàn)有的研宄表明，鐵螯合肽可以大大提高鐵離子的吸收利用率，同時多肽也具有多種顯著的生物活性，表現(xiàn)出雙重功效。
[0005]基于此，本發(fā)明根據(jù)鐵螯合肽和帶魚魚肉蛋白多肽的研宄現(xiàn)狀，提供一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽，并提供這種鐵螯合肽的制備方法。
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【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現(xiàn)狀提供一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽。
[0008]本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽的制備方法。
[0009]本發(fā)明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)，ESI/MS 測定分子量為 1045.18 Da。
[0010]本發(fā)明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)帶魚魚肉的預處理:將洗凈、去骨和皮的帶魚魚肉按照固液比I g:2 mL ~3mL放入磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.5)中，用高速組織搗碎機將其處理成勻漿，然后按照體積比1:3~ 5mL放入乙釀中脫脂4 ~ 6 h，4 °C、5000 ~ 6000 rpm, 15 ~ 20 min離心除去乙醚，沉淀物冷凍干燥即為脫脂帶魚魚肉。
[0011])帶魚魚肉蛋白的酶解:按照料液比lg:20~25mL向脫脂帶魚魚肉中加入磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.5)，按照脫脂帶魚魚肉質量的1.5-2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶(酶活力彡2.0X 14 U/g)，于溫度55~65°C下酶解4~6 h后，將溶液升溫至90°C ~ 95°C，并于此溫度保持10~15min后，冷卻至室溫；用NaOH調溶液pH到7.5-8.5，按照蛋白質量的
1.5 -2.0%向溶液中加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5 X 14 U/g)，于溫度35~45°C下酶解3~4 h，得酶解產(chǎn)物；
3)帶魚魚肉蛋白鐵螯合肽的制備:將制備的帶魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有10?15倍AB-8大孔樹脂的層析柱中，用3?5倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用5?8倍柱體積的95%乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚肉蛋白鐵螯合肽。
[0012]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的帶魚為日本帶魚(cAitf/YAs japonicus)。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟4)的凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
凝膠柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為25~30 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高鐵螯合活性的峰為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據(jù)對鐵的螯合活性得I個高鐵螯合活性肽Ala-Pr0-Pr0-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)。
[0014]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10~15 μ L ;色譜柱Kromasil C18 (250mmX4.6 mm, 5 μ m);流動相20%乙腈；洗脫速度0.8-1.0 mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
[0015]本發(fā)明基于多肽與金屬離子螯合的理論基礎，以及多肽-鐵螯合物的獨特功效(可同時補充多肽/氨基酸和鐵)，以帶魚魚肉為原材料，通過對木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高鐵螯合活性的多肽。本發(fā)明為補鐵保健食品和藥物開發(fā)提供了一種技術支持。
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【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠LH-20層析圖。
[0018]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠LH-20制備酶解物的RP-HPLC分析圖。
[0019]圖 3 是本發(fā)明的 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)的質譜圖。
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【具體實施方式】
[0021]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0022]一種源于帶魚魚肉蛋白的鐵螯合肽的制備方法，制備工藝流程如下:帶魚魚肉〃脫脂〃酶解〃酶解物〃超濾"AB-8大孔樹脂純化〃凝膠過濾層析"RP-HPLC制備〃鐵螯合肽。
[0023]實施例:I)帶魚魚肉的預處理:將洗凈、去骨和皮的日本帶魚(Trichiurusj'a/7o/?icw5.)魚肉按照固液比I g: 3mL放入緩沖液中，用高速組織搗碎機將其處理成勾楽，然后按照體積比1: 5mL放入乙醚中脫脂5 h，4 °C、6000 rpm，15 min離心除去乙醚，沉淀物冷凍干燥即為脫脂帶魚魚肉。
[0024]2)帶魚魚肉蛋白的酶解:按照料液比Ig: 25 mL向脫脂帶魚魚肉中加入磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L, pH 6.5)，按照脫脂帶魚魚肉質量的2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶(酶活力彡2.0X104 U/g)，于溫度60°C下酶解6 h后，將溶液升溫至95°C，并于此溫度保持10min后，冷卻至37°C ;用NaOH調溶液pH到8.0，按照蛋白質量的2.0%向溶液中加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5父104~8)，于溫度37°0下酶解4 h，得酶解產(chǎn)物；
3)帶魚魚肉蛋白鐵螯合肽的制備:將制備的帶魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有15倍AB-8大孔樹脂的層析柱中，用5倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用6倍柱體積的95%乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低