用于治療豚草變態(tài)反應的包含Amb a 1肽的疫苗的制作方法
【專利說明】用于治療豚草變態(tài)反應的包含Amba1肽的疫苗
[0001] 本申請是申請日為2009年8月14日，申請?zhí)枮?00980139316. 6,發(fā)明名稱為"用 于治療豚草變態(tài)反應的包含Amba1肽的疫苗"的申請的分案申請。
[0002] 通討引用并入
[0003] 以下優(yōu)先權(quán)申請的內(nèi)容通過引用并入本文：2008年8月15日提交的英國專利申 請第0814986. 6號；均在2008年8月15日提交的國際專利申請第PCT/GB08/002781和PCT/ GB08/002779號；2008年8月20日提交的英國專利申請第0815218. 3號和2009年5月1 日提交的歐洲專利申請第09251252. 4號。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及用于預防或治療對豚草的變態(tài)反應的組合物。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] T細胞抗原識別需要抗原呈遞細胞（APC)在其細胞表面上呈遞與主要組織相容性 復合物（MHC)的分子締合的抗原片段（肽）。T細胞使用其抗原特異性T細胞受體（TCR) 來識別由APC呈遞的抗原片段。這樣的識別作為免疫系統(tǒng)的觸發(fā)器起作用來產(chǎn)生一系列應 答以根除已被識別的抗原。
[0007] 生物體如人類的免疫系統(tǒng)對外部抗原的識別可在某些情況下造成疾病，其被稱作 特應性疾患。后者的實例是變應性疾病，包括哮喘、特應性皮炎和變應性鼻炎。在這一組疾 病中，B淋巴細胞產(chǎn)生對外源產(chǎn)生的抗原結(jié)合的IgE類抗體（在人類中），所述抗原在本文 稱為變應原，因為這些分子引發(fā)變應性應答。變應原特異性IgE的產(chǎn)生依賴于也被變應原 活化（并對其有特異性）的T淋巴細胞。借助于諸如嗜堿性細胞和肥大細胞的細胞對IgE 表面受體的表達，變應原特異性的IgE抗體結(jié)合到這些細胞表面。
[0008] 變應原對結(jié)合在表面的IgE分子的交聯(lián)造成這些效應細胞脫粒，導致炎癥介質(zhì)諸 如組胺、5-輕色胺和脂質(zhì)介質(zhì)如硫橋白三?。╯ulphidoleukotriene)的釋放。除了IgE依 賴性事件，某些變應性疾病諸如哮喘的特征為IgE獨立性事件。
[0009]目前用提供癥狀緩解或預防的劑來治療IgE介導的變應性疾病。這種劑的實例是 抗組胺劑、0 2激動劑和糖皮質(zhì)類固醇。此外，通過包括變應原成分或提取物的定期注射的 去敏化程序來治療一些IgE介導的疾病。去敏化治療可誘導與IgE競爭變應原的IgG應答， 或可誘導阻斷針對變應原的IgE的合成的特定抑制性T細胞。這種形式的治療不是總有效， 并且具有激起嚴重副作用特別是一般變應性休克的風險。這可以是致命的，除非立即意識 到并用腎上腺素治療。將減少或消除針對特定變應原的不想要的變應性-免疫應答的、而 不改變對其它外來抗原的免疫反應性的、或不觸發(fā)本身變應性應答的治療性處理將對變應 性個體大有益處。
[0010] 普遍認為，豚草變應原是包括哮喘、變應性鼻炎和變應性皮炎在內(nèi)的人類和動物 變應性疾病的主要原因。豚草花粉中存在的蛋白尤其重要。例如，美國大約75%的枯草熱 患者對豚草花粉是變應性的?？莶轃崾且环N形式的季節(jié)性變態(tài)反應的統(tǒng)稱，其特征是噴嚏、 流鼻涕和目癢。術(shù)語"枯草熱"出現(xiàn)是因為這種形式的變應性疾病在"采干草季節(jié)"期間最 流行，這對應許多植物的開花季節(jié)，此時其釋放最大量的花粉。這從夏末到早秋尤其流行， 尤其是從六月末到九月末（在北半球）。
[0011] 已計算獲得，對于美國成年人，枯草熱是第5種主要的慢性病，是缺勤的主要原 因，導致每年失去或減少近400萬個工作日，造成總生產(chǎn)力損失方面共超過7億美元的損 失。變態(tài)反應還是最頻繁報告的兒童慢性疾患，限制了多于40%兒童的活動。每年在美國， 變態(tài)反應占多于1700萬門診辦公室拜訪；季節(jié)性變態(tài)反應諸如枯草熱占這些變態(tài)反應拜 訪的多于一半。
[0012] 因此，治療性或預防性治療對于患有豚草變態(tài)反應或處于患豚草變態(tài)反應風險中 的人們將大有益處。
[0013] 發(fā)明概沐
[0014] 豚草變態(tài)反應通常是由豚草（Ambrosiaartemisiifolia)造成的。豚草花粉中的 主要變應原是41^&1。這種蛋白以大量不同同種型存在411*&1.1、1.2、1.3和1.4。本 發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，來源于Amba1蛋白的肽片段的某些組合對于使個體對這些變應原 去敏化特別有用。選擇本發(fā)明的多肽組合是由于它們的如下能力：結(jié)合許多MHCII類分 子、高度可溶、不觸發(fā)來自從一組豚草變應性個體提取的嗜堿性細胞的組胺釋放、和在一組 豚草變應性個體的高比例受治療者中誘導細胞因子應答。因此，可向個體提供本發(fā)明的組 合物、產(chǎn)物、載體和制劑以通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態(tài)反應。
[0015]通過計算機模擬方法選擇本發(fā)明的肽為可能的T細胞表位。當鑒定包含表位的區(qū) 域時，進一步分析它們來確定其中哪些在四種不同Amba1同種型之間是高度保守的。然 后進一步篩選這些候選多肽在免疫耐受中的潛在用途。更具體地，分析其溶解度特征、和誘 導細胞因子從來源于豚草變應性個體的PBMC的釋放能力。在一些情形，改造肽序列以改進 溶解度和/或減少二聚體形成。
[0016] 與基于肽免疫的去敏化方法相關(guān)的困難在于如何選擇變應原的合適的大小和區(qū) 域作為用于免疫的肽的基礎(chǔ)。所選擇的肽的大小是關(guān)鍵的。如果肽太小，疫苗將不能有效 引起免疫應答。如果肽太大，或如果將完整抗原引入個體，則存在引起副作用諸如過敏反應 的風險，這可能是致命的。如果肽可溶性差，這種風險可能更大。
[0017] 已經(jīng)選擇本發(fā)明的多肽以保持T細胞特異性，同時所述多肽的尺寸足夠小以不具 備將使其保留完整分子的IgE結(jié)合表位的構(gòu)象的顯著三級結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的多肽不引 起細胞諸如肥大細胞和嗜堿性細胞上相鄰的特異性IgE分子的顯著交聯(lián)，并已顯示不導致 來自人類嗜堿性細胞的顯著組胺釋放。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)勢是肽廣泛地靶向主要組織相容性復合物（MHC)分子的能力。T細胞 受體（TCR)在其特異性方面是高度可變的。如同抗體分子一樣，經(jīng)由細胞中的基因重組事 件產(chǎn)生變異性。TCR識別結(jié)合到由主要組織相容性復合物（MHC)的基因所編碼的分子的短 肽形式的抗原。這些基因產(chǎn)物是產(chǎn)生用于移植中的"組織型"的相同分子，并且還被稱為人 類白細胞抗原分子（HLA)，該術(shù)語可被互換地使用。單獨的MHC分子具備肽結(jié)合溝，由于它 們的形狀和電荷，其只能夠結(jié)合有限的一組肽。被一個MHC分子結(jié)合的肽可能不一定被其 它MHC分子結(jié)合。
[0019] 當?shù)鞍追肿又T如抗原或變應原被抗原呈遞細胞諸如B淋巴細胞、樹突細胞、單核 細胞和巨噬細胞吸收時，該分子在細胞中被酶促降解。降解過程產(chǎn)生所述分子的肽片段，如 果它們具有合適的大小、電荷和形狀，則可能結(jié)合到某些MHC分子的肽結(jié)合溝之內(nèi)，并隨后 展示在抗原呈遞細胞表面上。如果肽/MHC復合物以足夠數(shù)量呈遞在抗原呈遞細胞表面上， 則它們可能活化帶有合適的肽/MHC特異性T細胞受體的T細胞。
[0020] 由于MHC的多態(tài)性質(zhì)，遠系繁殖群體諸如人類中的個體將在其細胞表面上表達不 同組合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、電荷和形狀而結(jié)合來自同一分子的 不同肽，不同個體將展示與其MHC分子結(jié)合的不同庫的肽。鑒定遠系繁殖群體諸如人類中 的通用MHC-結(jié)合肽表位比在近親繁殖的動物（諸如實驗小鼠的某些品系）中更困難?；?于個體之間MHC的差異表達以及其帶來的肽結(jié)合與呈遞的固有差異，不太可能鑒定可用于 人類去敏化治療的單種肽。
[0021] 本發(fā)明的另一益處是基于在豚草變應性個體新鮮分離的PBMC中觀察的應答來選 擇肽和肽組合。不同于其中為了檢驗T細胞應答而從變應性患者建立克隆細胞系的人造情 況，評價新鮮分離的PBMC的先體外后體內(nèi)應答允許代表性地觀察不同肽的相對群體重要 性而沒有培養(yǎng)過程引起的可能的變形。
[0022] 然而，本發(fā)明的肽組合通過靶向多種不同MHC分子而提供對人類群體覆蓋面廣泛 的效力。這種廣泛的覆蓋面由本發(fā)明的肽組合在群體的許多個體中導致陽性細胞因子應答 的能力來闡釋。因此，以本發(fā)明的肽配制的疫苗將具有廣泛的應用。
[0023] 本發(fā)明人的工作產(chǎn)生了具有以下特征的肽組合：
[0024] _該組合在來自一組豚草變應性個體的高比例受治療者中誘導細胞因子應答；
[0025]-組合中的肽是可溶的；
[0026] _組合中的肽在一組豚草變應性個體中不引起顯著的組胺釋放。
[0027] 因此，本發(fā)明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態(tài)反應的組合 物，所述組合物包括選自SEQIDNO1至31的至少一種多肽。通常，該組合物包括至少四 種多肽，其中所述多肽獨立地選自以下任一種：
[0028] (i)SEQIDNO1 至 31 的多肽；或
[0029] (ii)根據(jù)（i)的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所 述多肽包含由以下組成的區(qū)域：
[0030] -⑴的任何序列；或
[0031] -與⑴的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得
[0032] 個體免疫耐受（i)的任何序列；或
[0033] (iii)根據(jù)（i)的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所 述多肽包含由表示以下任一個的序列組成的區(qū)域：
[0034] _(i)的任何序列的片段；或
[0035]-⑴的任何序列的片段的同系物，
[0036] 該序列能夠使得個體免疫耐受（i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度，而 且其中所述同系物與（i)的任何序列中任何9個連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性。
[0037] 此外，本發(fā)明還提供了以下方面的公開內(nèi)容：
[0038] A1. -種用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態(tài)反應的組合物，該組合 物包括：
[0039] (i)選自RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQIDNO. 9、8 或 7)的至少一種原始多肽或 其變體；
[0040] (ii)選自RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQIDNO.1、2或 3)的至少一種原始多肽或 其變體；
[0041]iii)選自RGW04或RGW04A(SEQIDNo: 10或11)的至少一種原始多肽或其變體； 和
[0042] (iv)任選地，獨立地選自SEQIDNO. 4-6和12-31的任一種的一種或多種原始多 肽或其變體；
[0043] 其中所述變體是：
[0044] (a)長度為9至20個氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下所組成的區(qū)域：
[0045] _等效的原始肽序列；或
[0046]-與等效的原始肽序