黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽及其應(yīng)用，具體涉及特異性抑制腫 瘤組織的血管內(nèi)皮細胞的增殖和迀移，抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 1971年Folkman提出腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成。并認為實體瘤形成后， 其發(fā)展可分為無血管期和血管期兩個階段。無血管期，微小腫瘤的存在依靠周圍間質(zhì)彌散 供血，生長速度呈線性，腫瘤限制在1mm~2mm之內(nèi)，瘤細胞數(shù)少于105~10 6個，迫使腫瘤 處于"休眠狀態(tài)";進入血管期后，腫瘤組織為灌注性供血，瘤體呈指數(shù)性生長，2周后可增大 1. 6萬倍。新生血管不僅提供腫瘤所需要的營養(yǎng)和氧氣，排除代謝產(chǎn)物，而且是遠處轉(zhuǎn)移的 途徑。因此，阻斷腫瘤新生血管形成就可能阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，抗新生血管療法也成為腫 瘤治療的手段之一。
[0003] 血管內(nèi)皮與基質(zhì)細胞黏附分子對腫瘤血管生成的作用越來越受到關(guān)注。黑色素瘤 細胞粘附分子（melanomacelladhesionmolecule，MCAM)是重要的細胞黏附蛋白，研宄報 道黑色素瘤細胞粘附分子是一個新的腫瘤血管標(biāo)志分子，特異表達在腫瘤新生血管并參與 腫瘤血管生成。黑色素瘤細胞粘附分子具有膜受體的功能，參與VEGF調(diào)節(jié)血管生成過程。 研宄發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌物中的某種因子能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細胞粘附分子二聚化，通過P38MAPK 信號通路活化NF-kB，上調(diào)多種促血管生成基因（VEGF、IL-8、ICAM-1、MMP9)的表達，從而 促進腫瘤血管的生成。動物實驗表明，⑶146中和抗體AA98或⑶146siRNA都能夠顯著抑 制血管內(nèi)皮細胞的增殖和迀移，以及多種腫瘤（肝癌、黑色素瘤、肉瘤）的生長和轉(zhuǎn)移。因 此，抑制黑色素瘤細胞粘附分子可以有效抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長，使腫瘤處 于"休眠狀態(tài)"。
[0004]目前，沒有成熟開發(fā)的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽問世，用于治療惡性腫 瘤。
[0005] 本專利中的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽已證明在治療黑色素瘤中有效，具 有在其他腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽，特異性抑 制腫瘤組織的血管內(nèi)皮細胞的增殖和迀移，對惡性腫瘤具有很好的療效。
[0008] 技術(shù)方案
[0009] 黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽，其特征在于其序列為 DNGVLVLLNVLETGVEEVKS〇
[0010] 所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011] 一種檢測黑色素瘤的試劑盒，其含有所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽。
[0012] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0013] (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0014] (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
[0015]⑶抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA;
[0016] (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA
[0017] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20;
[0018] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0019] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0020] (8)黑色素瘤細胞粘附分子抗體；
[0021] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0022] 有益效果
[0023] 利用固相合成法化學(xué)合成黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽，該多肽具有全新的 序列，該多肽可靶向識別腫瘤內(nèi)皮細胞，并在體外抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，治療惡性腫 瘤，如黑色素瘤。我們發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽可以同時抑制血管內(nèi)皮細 胞迀移活力，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。并且可以作 為檢測試劑盒檢測腫瘤的發(fā)生。
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明多肽DNGVLVLLNVLETGVEEVKS由上海生工合成。
[0025] 實施例1
[0026] 黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽人血管內(nèi)皮細胞迀移的作用。
[0027] 采用劃痕實驗。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每 隔0. 5~lcm-道，橫穿過孔。每孔穿過3條線；將成對數(shù)生長的HUVEC細胞，以1.OX105 加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。第二天用10y1槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，以 劃痕和背后橫線的交叉點為固定觀察位點；實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的 實驗藥物黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物長春新堿； 空白組加入相同體積的溶劑，每孔設(shè)五個復(fù)孔；放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0,6,12， 24，36小時，拍照；測量0，6，12，24，36h劃痕寬度。以不同的時間點，記錄每孔三個固定位置 處劃痕寬度的變化，即為細胞迀移距離。按照公式計算迀移率（migrationrate，MR):迀移 率（MR)=(實驗第n小時的劃痕寬度一實驗第0小時的劃痕寬度）X100% /實驗第0小時 的劃痕寬度。結(jié)果，隨黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽濃度增加，迀移抑制率逐漸下降， 說明黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽能夠抑制人血管內(nèi)皮細胞迀移，抑制率為73. 7%。
[0028] 實施例2
[0029] 黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽對體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細胞的生長和存活 IC50。
[0030] 采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人血管內(nèi)皮細胞HUVEC，以1.OX105加入96孔培 養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物黑色素瘤細胞粘 附分子拮抗劑多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。 每孔設(shè)五個復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h 后，加入DMSO,孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式HUVEC生長抑制率= (1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X100%。計算出實驗藥物的IC50為13. 53yM。
[0031] 實施例3
[0032] 用腫瘤模型檢測黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽的體內(nèi)活力。
[0033] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗 組多肽（上海生工合成）設(shè)3個劑量：0. 75、1.5、3mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計 算存活率。結(jié)果顯示，黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小 鼠的生存率，生存率達到76. 35%。
[0034] 實施例4含有黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽的ELISA試劑盒檢測：
[0035] 酶連免疫吸附實驗（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0036] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml;
[0037] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml;
[0038] (3)抗體稀釋液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 2%BSA。稱取 0? 2gBSA加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml;
[0039] (4)封閉液：0?05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2.0%BSA。2.OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml;
[0040] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05 %Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0041] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0042] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0043] (8)黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽
[0044] (9)黑色素瘤細胞粘附分子抗體購自上海一研生物科技有限公司
[0045] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[0046] 使用方法：1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200yL，迅速 離心 12000rpm3min，取上清，按體積比 1 :2 加PBS，80°C水浴 30min，12000rpm3min取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆谩?、黑色素瘤細胞粘附分子抗體為包被抗體，將黑色素瘤細胞粘附分子 抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100yg/mL。96孔酶標(biāo)板每孔加入100yL，4°C包被過夜。 棄去包被液，加入封閉液200yL，37°C封閉lh。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血 清樣本100yL(稀釋比1 :50)和黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽100yL(10yg/ml)及 上述血清樣本50yL和黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽50yL的混合物，分成3組，37°C 孵育lh。棄去血清，PBST和自來水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標(biāo) 二抗100yL(稀釋比1:10000)，37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔加入100yL 底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反應(yīng)30min后，加入50yL2MH2S04終止反應(yīng)， 用酶標(biāo)儀在450nm波長測定每孔的光密度值0D450nm。結(jié)果：黑色素瘤細胞粘附分子詰抗 劑多肽可以和黑色素瘤細胞粘附分子抗體結(jié)合，并可以競爭血清中黑色素瘤細胞粘附分子 拮抗劑，故說明黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽用競爭法檢測黑色素瘤細胞粘附分子拮 抗劑，實現(xiàn)腫瘤預(yù)測；
【主權(quán)項】
1. 黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽，其特征在于其序列為DNGVLVLLNVLETGVEEVKS。
2. 如權(quán)利要求1所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物 中的應(yīng)用。
3. -種檢測黑色素瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗 劑多肽。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 黑色素瘤細胞粘附分子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為DNGVLVLLNVLETGVEEVKS是全新的序列，它們可以在體外特異性抑制腫瘤組織的血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值；并可以作為檢測試劑盒檢測腫瘤的發(fā)生。
【IPC分類】C07K7-08, G01N33-68, A61P35-00, G01N33-574, A61K38-10
【公開號】CN104710513
【申請?zhí)枴緾N201510158904
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月6日