血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽及其應用，具體涉及特異性抑制腫瘤組 織的血管內皮細胞的增殖和迀移，抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術】
[0002] 1971年Folkman提出腫瘤生長和轉移依賴新生血管生成。并認為實體瘤形成后， 其發(fā)展可分為無血管期和血管期兩個階段。無血管期，微小腫瘤的存在依靠周圍間質彌散 供血，生長速度呈線性，腫瘤限制在1mm~2mm之內，瘤細胞數少于105~10 6個，迫使腫瘤 處于"休眠狀態(tài)";進入血管期后，腫瘤組織為灌注性供血，瘤體呈指數性生長，2周后可增大 1. 6萬倍。新生血管不僅提供腫瘤所需要的營養(yǎng)和氧氣，排除代謝產物，而且是遠處轉移的 途徑。因此，阻斷腫瘤新生血管形成就可能阻止腫瘤生長和轉移，抗新生血管療法也成為腫 瘤治療的手段之一。
[0003] 血管內皮與基質細胞黏附分子對腫瘤血管生成的作用越來越受到關注。鈣聯蛋白 是一類依賴于鈣離子的膜蛋白，是重要的細胞黏附蛋白，負責細胞與細胞的識別及細胞與 組織的黏附。鈣聯蛋白的表達具有組織特異性，在血管內皮細胞表達的是血管內皮鈣聯蛋 白（VE-cadherin)，這是一個潛在的腫瘤血管生成的革E1標。目前報道有一個以VE_cadherin 為靶標的抗體E4G10可以特異性識別腫瘤血管并抑制其生成，而不識別正常的血管。這可 能是因為該抗體識別VE-cadherin的抗原表位在正常血管上被掩蓋，而在腫瘤血管上這個 表位被暴露出來，預示著潛在的臨床應用價值。由此可見，抑制VE-cadherin可以有效抑制 腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長，使腫瘤處于"休眠狀態(tài)"。
[0004] 目前，沒有成熟開發(fā)的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽問世，用于治療惡性腫瘤。
[0005] 本專利中的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽已證明在治療胰腺癌中有效，具有在其 他腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽，特異性抑制腫 瘤組織的血管內皮細胞的增殖和迀移，對惡性腫瘤具有很好的療效。
[0008] 技術方案
[0009] 血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽，其特征在于其序列為RCILTPCPASVMAVAATINPAY。
[0010] 血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽在治療惡性腫瘤，如胰腺癌藥物中的應用。
[0011] 有益效果
[0012] 利用固相合成法化學合成血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽，該多肽具有全新的序 列，該多肽可靶向識別腫瘤內皮細胞，并在體外抑制血管內皮細胞的增殖，治療惡性腫瘤， 如胰腺癌。我們發(fā)現的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽可以同時抑制血管內皮細胞迀移活 力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1
[0014] 血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽人血管內皮細胞迀移的作用。
[0015] 采用劃痕實驗。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每 隔0. 5~lcm-道，橫穿過孔。每孔穿過3條線；將成對數生長的HUVEC細胞，以1.OX105 加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。第二天用10y1槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，以 劃痕和背后橫線的交叉點為固定觀察位點；實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的 實驗藥物血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物長春新堿；空白 組加入相同體積的溶劑，每孔設五個復孔；放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0,6,12, 24， 36小時，拍照；測量0，6，12，24，36h劃痕寬度。以不同的時間點，記錄每孔三個固定位置處 劃痕寬度的變化，即為細胞迀移距離。按照公式計算迀移率（migrationrate，MR):迀移率 (MR)=(實驗第n小時的劃痕寬度一實驗第0小時的劃痕寬度）X100% /實驗第0小時 的劃痕寬度。結果，隨血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽濃度增加，迀移抑制率逐漸下降，說明 血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽能夠抑制人血管內皮細胞迀移，抑制率為78. 3%。
[0016] 實施例2
[0017] 血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽對體外培養(yǎng)人血管內皮細胞的生長和存活IC50。
[0018] 采用MTT比色法。將對數生長的人血管內皮細胞HUVEC，以1.OX105加入96孔培 養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物血管內皮鈣聯蛋 白拮抗劑多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每 孔設五個復孔，培養(yǎng) 48h，分別在 011、211、811、1411、2011、2411、3611、，4811每孔加入]\〇'1'，作用411 后，加入DMS0,孵育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式HUVEC生長抑制率= (1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X100%。計算出實驗藥物的IC50為12. 52yM。
[0019] 實施例3
[0020] 用腫瘤模型檢測血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽的體內活力。
[0021] 建立胰腺癌腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組 多肽（上海生工合成）設3個劑量：0. 25、0. 50、1. 00yM/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量， 計算存活率。結果顯示，血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠 的生存率，生存率達到78. 5%。
[0022] 實施例4含有血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽的ELISA試劑盒檢測：
[0023] 酶連免疫吸附實驗（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0024] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml;
[0025] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml;
[0026] (3)抗體稀釋液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 2%BSA。稱取 0? 2gBSA加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml;
[0027] (4)封閉液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0%BSA。2.OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml;
[0028] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7.4)和0? 05 % Tween-20。將50ulTween-20溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0029] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0030] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0031] (8)血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽
[0032] (9)VE_cadherin抗體購自上海一研生物科技有限公司
[0033] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[0034] 使用方法：1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200yL，迅速 離心 12000rpm3min，取上清，按體積比 1 :2 加PBS，80°C水浴 30min，12000rpm3min取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆谩?、VE-cadherin抗體為包被抗體，將VE-cadherin抗體溶于包被稀釋 液中，濃度為100ug/mL。96孔酶標板每孔加入100yL，4°C包被過夜。棄去包被液，加入封 閉液200yL，37°C封閉lh。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣本100yL(稀釋 比1 :50)和血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽100yL(10yg/ml)及上述血清樣本50yL和血 管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽50yL的混合物，分成3組，37°C孵育lh。棄去血清，PBST和自 來水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標二抗100uL(稀釋比1 :10000)， 37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔加入100yL底物液（50yL底物A，50yL底物 B)，37°C反應30min后，加入50yL2MH2S04終止反應，用酶標儀在450nm波長測定每孔的 光密度值〇D450nm。
[0035] 結果：血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽可以和VE-cadherin抗體競爭血清中結合 VE-cadherin，故說明血管內皮媽聯蛋白詰抗劑多肽用競爭法檢測VE-cadherin，
[0036] 實現腫瘤預測；
【主權項】
1.血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽，其特征在于其序列為RCILTPCPASVMAVAATINPAY。
2. 如權利要求1所述的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽在治療腫瘤藥物中的應用。
3.如權利要求1所述的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽在治療胰腺癌藥物中的應用。
4. 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19.6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7.4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3)抗體稀釋液：pH7. 4的0? 02mol/LPBS和0? 2% BSA ; (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和0? 05% Tween-20 ; (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7)終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 成纖維細胞生長因子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】血管內皮鈣聯蛋白拮抗劑多肽及其應用。本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為RCILTPCPASVMAVAATINPAY是全新的序列，它們可以在體外特異性抑制腫瘤組織的血管內皮細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值，可以作為檢測試劑盒檢測腫瘤。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-574, C07K14-00, A61K38-16, A61P35-00
【公開號】CN104710514
【申請?zhí)枴緾N201510158902
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月6日