人乳頭瘤病毒l1蛋白突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一種人乳頭瘤病毒L1蛋白突變體，同時(shí)還提供了其制備方法，以及包 含至少一種所述突變體的藥物組合物，特別是包含至少一種所述突變體的疫苗，屬于生物 制藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大量分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究已經(jīng)證明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV45等高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,簡(jiǎn)寫為：HPV)在人體內(nèi)持續(xù)感染是 引起宮頸癌發(fā)生的主要病因。不同人群中一系列研究已證實(shí)生殖道的HPV16、HPV18型感染 與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，較其它危險(xiǎn)因素更密切。HPV是乳多空瘤病毒科多瘤病毒亞科的 一個(gè)無(wú)包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，它是乳頭瘤病毒（PV)屬中的一個(gè)成員，根據(jù)宿主范 圍，可分成人、牛、兔、狗、馬、羊、豬、鼠等乳頭瘤病毒亞家族成員。其基因組含有8個(gè)開放閱 讀框（0RF)和一個(gè)上游調(diào)節(jié)區(qū)（URR)，其中6個(gè)0RF編碼的蛋白在病毒復(fù)制的早期表達(dá)， 稱為早期蛋白；2個(gè)0RF編碼的蛋白在病毒復(fù)制的晚期表達(dá)，稱為晚期蛋白。晚期蛋白包 括主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2，與病毒的增殖有關(guān)。（deVilliersEM，F(xiàn)auquet C，Broker TR，Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004; 324(1): 17~ 27.)無(wú)論是原核，還是真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Ll蛋白在近 生理環(huán)境中均可自發(fā)地形成穩(wěn)定的五聚體，并且72個(gè)五聚體進(jìn)一步自組裝后形成T=7的 二十面體結(jié)構(gòu)的類病毒顆粒（VLPs)。主要衣殼蛋白L1約有504個(gè)殘基，分子量約為58 kDa。L1的三級(jí)結(jié)構(gòu)有兩個(gè)突出的結(jié)構(gòu)域（Chen XS, Garcea RL, Goldberg I，Casini G, Harrison SC. Structure of small virus-like particles assembled from the Ll protein of human papillomavirus 16. Mol Cell. 2000;5 (3):557-567.)(圖1): 一個(gè) 典型的"果凍卷" 折疊桶，包含Ll多肽鏈的殘基20-382 ;hl_h5為5個(gè)a -螺旋，包含殘 基383-475。5個(gè)等同的L1亞基形成一個(gè)五聚體（圖2)在五聚體殼粒里，每個(gè)L1亞基的 a-螺旋4 (h4,殘基414-429)形成突出的亞結(jié)構(gòu)域后，離開它們所屬的五聚體向外延伸， 并侵入鄰近五聚體的L1的a -螺旋2和3 (h2和h3)里。a -螺旋5 (h5)與短的0 J股 段一起鎖定鄰近亞基羧基端的側(cè)面突出部分，加強(qiáng)了五聚體內(nèi)的聯(lián)系。從T=7晶體結(jié)構(gòu)可 知，a -螺旋h2、h3和h5的缺失，影響五聚體形成；h4的缺失，影響VLPs的形成，但不影響 五聚體的形成。
[0003]目前，已知的HPV有100多種亞型，由于HPV具有種屬特異性，且不能在體外細(xì)胞 培養(yǎng)，要獲得該病毒的特異性抗原，只能用重組DNA技術(shù)的方法制備基因工程疫苗。重 組L1或L1/L2在體內(nèi)可自組裝形成病毒樣顆粒VLPs，該顆粒直徑約55nm，無(wú)病毒DNA，安全 性好，具有和天然病毒顆粒相似的抗原表位，刺激機(jī)體后可產(chǎn)生中和抗體IgG和IgA，因此 HPVVLPs可作為預(yù)防性疫苗，從而避免因感染HPV導(dǎo)致產(chǎn)生相關(guān)腫瘤的可能性。 目前，HPV疫苗制備技術(shù)已逐漸趨于成熟，但是還存在許多問(wèn)題。主要有以下幾個(gè) 方面：（1)由于80%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家和較貧困地區(qū)，因此改善疫苗制備工藝， 降低生產(chǎn)成本顯得尤為重要。（2)據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年全球大約有47萬(wàn)例新發(fā)宮頸癌病例， 到目前為止尚無(wú)逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的感染和已經(jīng)存在的病灶得以消除的有效辦法。盡快研制出 治療和兼有預(yù)防治療雙重作用HPV疫苗時(shí)不以待。（3)致病的HPV種類很多，目前已分離 出HPV型別中有三十多種致癌。（DellG,GastonK,Humanpapillomavirusesandtheir roleincervcalcaner.CellMolLifeSci. 2001; 58(12-13): 1923-1942.)因?yàn)镠PV 的種屬特異性，因此，目前已有的無(wú)論是二價(jià)還是四價(jià)疫苗都不能抵擋所有型別的HPV感 染。有研究表明L2可以誘導(dǎo)交叉性中和抗體的產(chǎn)生，這或許能夠?yàn)檠芯烤哂薪徊姹Ｗo(hù)作用 的商效疫苗提供思路。
[0004] 選擇適宜的載體表達(dá)系統(tǒng)是研制HPV疫苗的重要環(huán)節(jié)，也是影響表達(dá)水平及蛋白 活性的關(guān)鍵步驟。理想的載體應(yīng)具有穩(wěn)定的無(wú)毒表型，不與宿主染色體發(fā)生整合，能有效表 達(dá)具有免疫原性的外源基因序列，接種后不會(huì)在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期留存的特點(diǎn)。HPV疫苗研究 中應(yīng)用較多的是酵母菌、昆蟲細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，但其穩(wěn)定性差、造價(jià)高，不 利于其在發(fā)展中國(guó)家的推廣使用。而最初的HPVL1和L2衣殼蛋白是在原核細(xì)胞--大腸 桿菌中表達(dá)成功的，原核生物容易培養(yǎng)，表達(dá)量高，成本低，但容易形成包涵體，需要經(jīng)過(guò)復(fù) 雜的變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，VLPs產(chǎn)率很低。因此，在大腸桿菌體系 中，提高VLPs產(chǎn)率可以有效地降低HPV疫苗的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種人乳頭瘤病毒L1蛋白的突變體。
[0006] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述突變體的制備方法，以及包含至少一種所述突變體 的藥物組合物，特別是包含至少一種所述突變體的疫苗。
[0007] 本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒L1蛋白的突變體，其特征在于:人乳頭瘤病毒L1 蛋白C末端a-螺旋5FPLGRKFL*LQAG中的亮氨酸L*突變成丙氨酸A或絲氨酸S，優(yōu)選突 變?yōu)楸彼酇。
[0008] 本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒L1蛋白的突變體，其特征在于：所述人乳頭瘤病毒 L1 蛋白是指 6、11、16、18、31、33、34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73 或 82、85、97型HPV中一種和/或幾種的組合。
[0009] 本發(fā)明還提供編碼該蛋白突變體的多核苷酸基因片段(如SEQNO. 2、SEQN0. 3、 SEQNO. 5)、包含該基因片段的載體、包括載體的宿主細(xì)胞，以及由該蛋白突變體形成的 HPVL1蛋白五聚體。
[0010] 本發(fā)明另一個(gè)目的是包含至少一種所述突變體的藥物組合物，具體的說(shuō)，藥物組 合物的有效成份為由該蛋白突變體形成的HPVL1蛋白五聚體。
[0011] 本發(fā)明第三方面是涉及包含至少一種所述突變體的疫苗，具體地說(shuō)疫苗由抗原和 藥物佐劑制成，該抗原主要包括由上述突變體蛋白形成的HPVL1五聚體。
[0012] 本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒L1蛋白突變體的五聚體的制備方法，包括以下步驟： 1、 以N端去掉4個(gè)氨基酸、C端去掉29個(gè)氨基酸的截短野生型人乳頭瘤病毒HPV16L1 (簡(jiǎn)稱：16WT)和HPV18L1 (簡(jiǎn)稱：18WT)基因序列為模板，設(shè)計(jì)帶有突變位點(diǎn)的寡聚脫氧核 糖核酸(引物)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)，對(duì)含有突變位點(diǎn)的核苷酸片段進(jìn)行擴(kuò)增； 2、 以pGEX-6p-l為載體片段，將突變體核苷酸片段連接于載體的多克隆位點(diǎn)上（BamH I和NotI)，并將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞（E.coli，DH5a)中進(jìn)行重組子的篩選； 3、 獲得重組載體后，以XA90 (E.coli)為表達(dá)宿主細(xì)胞進(jìn)行突變體蛋白的表達(dá)； 4、 利用親和層析以及體積排阻色譜純化L1蛋白突變體的五聚體，用SDS-PAGE蛋白質(zhì) 凝膠電泳和蛋白免疫印跡法確定得到的蛋白是L1蛋白突變體的五聚體。
[0013] 本發(fā)明與對(duì)應(yīng)的16WT，18WT相比，所述突變體HPV16L1L469A(簡(jiǎn)稱：L469A)、HPV 16L1L469S(簡(jiǎn)稱：L469S)和突變體HPV18L1L470A(簡(jiǎn)稱：L470A)得到的可溶性五聚體 (正確折疊的L1蛋白）在可溶性蛋白總量中的比例均顯著增加，并且突變體L1蛋白五聚體 可以進(jìn)一步組裝成類病毒顆粒VLPs，大小53nm左右，與野生型HPV病毒顆粒相似。其中，突 變體L469A和L470A的蛋白表達(dá)產(chǎn)量和可溶性五聚體的蛋白產(chǎn)量均有所提高，其可溶性五 聚體的產(chǎn)量大約是野生型的2倍(即突變體VLPs產(chǎn)量是野生型的2倍)。
[0014] 在本發(fā)明中，把HPVL1蛋白C末端a-螺旋5 "FPLGRKFL*LQAG"中的亮氨酸L*突 變成更親水性的丙氨酸（Ala，A)或絲氨酸（Ser，S)后，明顯提高了L1蛋白可溶性五聚體的 產(chǎn)率和由其組裝成的類病毒顆粒VLPs的產(chǎn)率，從而有效地降低HPV疫苗的生產(chǎn)成本。比較 HPV6、11、16、18、31、33、34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73 或 82、85、 97型L1蛋白的h5序列（圖3)，在h5中的亮氨酸L*這一點(diǎn)是高度保守的，說(shuō)明在h5中的 這一點(diǎn)在L1蛋白結(jié)構(gòu)和功能上具有重要的作用，并且這一點(diǎn)突變具有普適性，因而可以推 廣到所有HPV型別中，這些突變?yōu)榈诙畠r(jià)、廣譜HPV疫苗的研發(fā)提供方案和可行性。
[0015] 本發(fā)明的積極效果在于： 在原核細(xì)胞大腸桿菌中，把HPVL1蛋白C末端a-螺旋5FPLGRKFL*LQAG中的亮氨 酸L*突變成更親水性的丙氨酸(Ala，A)或絲氨酸（Ser，S)后，明顯提高了L1蛋白可溶性 五聚體的產(chǎn)率和由其組裝成的類病毒顆粒VLPs的產(chǎn)率，從而有效地降低HPV疫苗的生產(chǎn)成 本。
[0016]
【附圖說(shuō)明】： 圖1是HPV16的亞基L1結(jié)構(gòu)。
[0017] 圖2是HPV16的L1五聚體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖3是25個(gè)不同HPV型別的L1蛋白a-螺旋5 (h5)序列對(duì)比圖。
[0019]圖4是HPV16L1U8L1突變體核苷酸片段的擴(kuò)增。
[0020] 圖5是HPV16L1、18L1突變體質(zhì)粒及BamHI/NotI雙酶切鑒定重組DNA片段。
[0021] 圖6是截短野生型16WT及其突變體L469A、L469S的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳 圖。
[0022] 圖7是截短野生型16WT及其突變體L469A、L469S的蛋白免疫印跡法 (Western-blot)鑒定圖。
[0023] 圖8是截短野生型16WT及其突變體L469A、L469S的體積排阻色譜圖。
[0024] 圖9是截短野生型18WT及其突變體L470A的體積排阻色譜圖。
[0025] 圖10是截短野生型16WT及其突變體L469A的⑶光譜圖。
[0026] 圖11是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS)分析組裝后類病毒顆粒VLPs粒徑大小及分布，粒 徑大小是53nm左右。
[0027] 圖12是HPV16L1L469A突變體組裝成類病毒蛋白顆粒VLPs的TEM圖。
[0028] 圖13是免疫后的小鼠血清中中和抗體滴度圖。
[0029]
【具體實(shí)施方式】： 以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和原 則的前提下，對(duì)發(fā)明個(gè)別技術(shù)步驟進(jìn)行的任何改動(dòng)和改變都將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范 圍。
[0030] 實(shí)施例1.突變體基因片段的構(gòu)建 分別以含有截短野生型16WT、18WT基因片段的載體