一種特異性結(jié)合PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9的納米抗 體及其在抗PRRS病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS) 又名藍(lán)耳病，是由PRRS病毒（PRRSV)感染所致的一種豬的急性傳染病。由于PRRS病毒 具有抗原變異性、嗜巨噬細(xì)胞性、抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE)和持續(xù)性感染等特征（Chand RJ：Pathogenesisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Curr OpinVirol，2012, 2 (3) : 256-263)，現(xiàn)有疫苗對該病的保護(hù)作用非常有限，而且目前還沒有 抗PRRS病毒的特效藥物。
[0003] PRRS病毒為單股正鏈RNA病毒，其基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于病毒自身編碼 的非結(jié)構(gòu)蛋白，其中非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9具有RNA依賴的RNA聚合酶活性（FangY:The PRRSVreplicase:exploringthemultifunctionalityofanintriguingsetof nonstructuralproteins.VirusResearch, 2010, 154 (2) :61-76)，是病毒最重要的復(fù)制 酶，并且最新的研宄發(fā)現(xiàn)Nsp9與病毒的毒力有著密切的關(guān)系。因此Nsp9非常合適作為抗 病毒藥物靶點(diǎn)。
[0004] 1993年Hamers等人發(fā)現(xiàn)駱駝體內(nèi)存在一種僅具有重鏈的抗體，將其稱為重鏈 抗體(heavy-chainantibodies,HCAbs)(Hamers-CastermanC:Naturallyoccurring antibodiesdevoidoflightchains.Nature, 1993, 6428(363) :446_448)。這類抗體的抗 原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH) 單結(jié)構(gòu)域形成。盡管天然缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。VHH抗體是 目前所發(fā)現(xiàn)的具有完整功能的最小分子抗體片段，分子量為15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10， 其分子高度4. 8nm，直徑2. 2nm，故被稱為納米抗體（nanobody)。VHH抗體重要的特征之一 是其具有更長的抗原互補(bǔ)結(jié)合區(qū)（CDR)，可結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接近的抗原表位，如位 于酶蛋白裂隙中的活性中心結(jié)構(gòu)G)eGenstE:Molecularbasisforthepreferential cleftrecognitionbydromedaryheavy-chainantibodies.ProcNatlAcadSci USA, 2006, 103(12) :4586-4591)。另外，它還具有易表達(dá)，水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，免疫原性弱， 組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，使得該抗體作為一種小型化的基因工程抗體在基礎(chǔ)研宄、藥物開發(fā) 等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種針對PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9并可以抑 制PRRS病毒增殖的納米抗體，同時(shí)提供該納米抗體的編碼序和一種真核表達(dá)載體。
[0006] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種針對PRRS病毒Nsp9的納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R， 所述框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列：SEQIDNO:l所示的FR1，SEQIDNO:2所示 的FR2,SEQIDNO:3所示的FR3,SEQIDNO:4所示的FR4 ;所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR選自下組 的CDR氨基酸序列：SEQIDNO: 5 所示的CDR1，SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO: 7 所 示的CDR3。
[0008] 所述的VHH鏈具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
[0009] -種特異性結(jié)合PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9納米抗體，所述的納米抗體來源于雙 峰駝重鏈抗體可變區(qū)片段，可以特異性結(jié)合PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9,具有權(quán)利要求1和 2所述的Nsp9納米抗體的VHH鏈。
[0010] -種DNA序列，所述DNA序列編碼所述的Nsp9納米抗體的VHH鏈，或所述的納米 抗體。
[0011] 所述的DNA序列具有SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
[0012] 一種表達(dá)載體，它含有所述的DNA序列。
[0013] 所述的表達(dá)載體可以在Marc-145細(xì)胞中表達(dá)納米抗體-eGFP融合蛋白，并可以 抑制PRRS病毒在Marc-145細(xì)胞中的增殖。
[0014] 所述的表達(dá)載體，具有SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列。
[0015] 所述的納米抗體在制備用于治療和防治PRRS藥物中的應(yīng)用。
[0016] 所述的DNA序列在開發(fā)抗PRRS轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為：
[0018] 本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)篩選到了抗PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9特異性納米抗 體。此納米抗體可以特異性結(jié)合Nsp9,利用該納米抗體的DNA序列構(gòu)建真核表達(dá)載體，將其 導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，納米抗體-eGFP以融合蛋白的形式在細(xì)胞中表達(dá)，并且具有抑制PRRS 病毒增殖的功能。該納米抗體可以開發(fā)為治療PRRS的藥物，其基因序列可用于抗PRRS轉(zhuǎn) 基因豬的研制。
【附圖說明】
[0019] 圖1是VHH基因電泳圖；其中泳道1和2是PCR擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)基因片段，泳 道M是DNA分子標(biāo)準(zhǔn)。
[0020] 圖2是ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定Nsp9納米抗體結(jié)果。
[0021] 圖3是檢測Marc-145細(xì)胞中表達(dá)的Nanobody-eGFP融合蛋白的WesternBlot 圖。泳道1是Marc-145細(xì)胞，泳道2是轉(zhuǎn)染了Nanobody-eGFP融合蛋白真核表達(dá)載體的 Marc-145細(xì)胞。圖4不同PRRSV毒株接種細(xì)胞48小時(shí)后培養(yǎng)上清中子代病毒滴度（TCID5Q)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明首先將Nsp9重組蛋白免疫一只阿拉善雙峰駝，經(jīng)過5次免疫之后分離該雙 峰駝外周血淋巴細(xì)胞并構(gòu)建了Nsp9特異的單域重鏈抗體文庫。將可溶性Nsp9重組蛋白包 被在酶標(biāo)板上，利用噬菌體展示技術(shù)篩選特異性結(jié)合Nsp9的納米抗體基因庫（駱駝重鏈抗 體噬菌體展示基因庫），獲得了Nsp9特異性納米抗體。構(gòu)建納米抗體真核表達(dá)載體，將其導(dǎo) 入Marc-145細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的Nsp9納米抗體可以高效地抑制PRRS病毒在Marc-145細(xì) 胞中的增殖。
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1 :針對于PRRS病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9的納米抗體文庫的構(gòu)建：
[0025] (1)將5mlNsp9重組蛋白（lmg/ml)與弗氏佐劑等體積混合并乳化均勻，免疫一只 阿拉善雙峰駝，每兩周1次，共免疫5次，除第一次使用弗氏完全佐劑，剩余幾次全部使用弗 式不全佐劑。（2) 4次免疫結(jié)束后，提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞并提取總RNA，參照QIAGENRNA 提取試劑盒說明書操作。（3)按照InvitrogenSuperscript?III第一鏈合成系統(tǒng)試劑 盒說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并利用套式PCR擴(kuò)增VHH鏈，第一輪PCR:
[0026]上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
[0027]下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
[0028] 擴(kuò)增重鏈抗體信