一種牛血清白蛋白納米微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種基于蛋白二聚作用制備牛血清白蛋白納米微球的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基于天然高分子的納米微球材料具有優(yōu)異的生物相容性和可調(diào)的生物降解性，可用于藥物、蛋白或基因的包埋和釋放，目前已廣泛用于藥物控釋、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究。通常，藥物在體內(nèi)代謝較快，而頻繁注射給藥則會給病人帶來極大的痛苦。選擇合適的納米載藥體系，可實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的緩慢釋放，達到理想的治療效果。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，納米微球常用于包埋細胞生長因子和基因，以提高細胞支架的生物活性，增加支架在體內(nèi)的組織誘導(dǎo)能力。常用來制備納米微球的天然高分子包括:牛血清白蛋白、明膠、殼聚糖、淀粉及纖維素等。
[0003]基于天然高分子材料的納米微球在制備工程中必須添加化學(xué)交聯(lián)劑處理，其結(jié)構(gòu)才能穩(wěn)定。這些化學(xué)交聯(lián)劑主要有多聚甲醛、戊二醛、水溶性碳化二亞胺和京尼平等，其作用是將天然高分子中的活性基團(如氨基、羧基和羥基等)經(jīng)過縮合而達到交聯(lián)的目的。雖然化學(xué)交聯(lián)劑能使納米微球在物理結(jié)構(gòu)上比較穩(wěn)定，但會導(dǎo)致包埋的活性蛋白類藥物(如細胞生長因子等)變性而失活，不適合用于活性蛋白的傳遞；同時，化學(xué)交聯(lián)劑具有細胞毒性，容易殘留在材料中。如能避免使用有毒的化學(xué)交聯(lián)劑，則有望得到高生物活性的納米微球材料，這是降低材料毒性及提高藥物輸送效率的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備牛血清白蛋白納米微球的方法，避免使用有毒的化學(xué)交聯(lián)劑，能保證材料的使用安全性和被包埋藥物的生物活性。
[0005]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:
一種牛血清白蛋白納米微球的制備方法，采用雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇為交聯(lián)分子，通過蛋白二聚作用及反相溶液法交聯(lián)制備牛血清白蛋白，包括以下步驟:
步驟1、室溫下將牛血清白蛋白溶于氯化鈉溶液中；
步驟2、氬氣保護下加入雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇溶液；
步驟3、室溫攪拌下滴加氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH ；
步驟4、室溫攪拌下滴加反相溶劑，至溶液混濁后停止攪拌；
步驟5、高速離心得到納米微球，洗滌、冷凍、干燥后得到牛血清白蛋白納米微球。
[0006]其中，步驟I中所述牛血清白蛋白在氯化鈉溶液中的質(zhì)量濃度為2?5%。
[0007]步驟2中所述雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇溶液的質(zhì)量濃度為0.4?1%。
[0008]步驟3中加入雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇后，混合溶液pH值調(diào)節(jié)至7?9。
[0009]步驟4中加入滴加的反相溶劑為丙酮或無水乙醇，滴加量為混合溶液體積的6?8倍。
[0010]步驟5中先后用蒸餾水、無水乙醇洗滌。
[0011]本發(fā)明采用雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇為交聯(lián)分子，在一定條件下能使牛血清白蛋白發(fā)生二聚作用產(chǎn)生交聯(lián)而得到穩(wěn)定的納米微球。雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇分子結(jié)構(gòu)中含有馬來酰亞胺基，它能與牛血清白蛋白分子中的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，同理含有馬來酰亞胺基的其它水溶性聚合物材料亦可作為交聯(lián)分子。
[0012]本發(fā)明制備的牛血清白蛋白納米微球分布均勻，平均直徑可控制在27?88納米。納米微球的直徑隨著牛血清白蛋白溶液的濃度的增加而變大，而乙二醇濃度對納米微球的尺寸影響不大。本發(fā)明所制備的多聚糖納米微球結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在磷酸鹽緩沖溶液中培養(yǎng)24小時后直徑變化很小，適用于體內(nèi)藥物治療。
[0013]原料和試劑:牛血清白蛋白，購于南京生興生物技術(shù)有限公司；雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇，購于上海西寶生物科技有限公司；丙酮，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、無水乙醇，分析純，成都科龍化工試劑廠。氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司。磷酸鹽緩沖溶液的配制:稱取分析純氯化鈉8克、氯化鉀0.2克、磷酸氫二鈉2.9克、磷酸二氫鉀0.2克，溶于1000毫升蒸餾水中。
[0014]納米微球的粒徑檢測:納米微球的直徑通過納米粒度分析儀(Malvern ZetasizerNano ZS)測算。
[0015]納米微球的形貌檢測:將干燥后的納米微球噴金(Cressington 108 Auto),在掃描電子顯微鏡(JSM-6330F，JEOL)上觀察微觀形貌。
[0016]本發(fā)明采用ANOVA方差分析法，顯著差異值/7設(shè)為< 0.05。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點是:I)避免使用了有毒化學(xué)交聯(lián)劑，所制備的納米微球中不存在毒性殘留，保證了納米微球的安全性；2)所涉及的蛋白二聚作用基于牛血清白蛋白與聚乙二醇分子之間，不與被包埋活性藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，能有效保護藥物的生物活性，特別適用于基因、活性蛋白類藥物的包埋與傳遞；3)本發(fā)明工藝和設(shè)備簡單、易行、操作安全，同時具有制備溫度低、處理周期短等優(yōu)點，適合商業(yè)化生產(chǎn)。
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細的描述。
【附圖說明】
[0019]圖1本發(fā)明制備納米微球的示意圖。
圖2為本發(fā)明實施例1納米微球的直徑與牛血清白蛋白濃度的關(guān)系。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例1納米微球的直徑與聚乙二醇濃度的關(guān)系。
[0021]圖4為本發(fā)明實施例1納米微球的直徑與pH值的關(guān)系。
[0022]圖5為本發(fā)明實施例1納米微球的直徑分布在37°C磷酸鹽緩沖溶液中孵育24小時后的變化(實線為孵育前，虛線為孵育后)。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明提供的一種制備牛血清白蛋白納米微球的方法，其步驟包括:
步驟1、配制濃度為1mM的氯化鈉水溶液，將10(T250mg牛血清白蛋白溶解于5ml氯化鈉溶液；
步驟2、將r1mg雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇溶解于Iml氯化鈉溶液中，氬氣保護下滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫下攪拌2?4小時；
步驟3、室溫攪拌下滴加濃度為IN的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為7、；
步驟4、室溫攪拌下滴加61倍體積的丙酮或乙醇，至溶液混濁；
步驟5、高速離心得到納米微球，隨后分別用蒸餾水、無水乙醇清洗，最后冷凍干燥。
[0024]實施例1:
(1)配制濃度為1mM的氯化鈉水溶液，將100牛血清白蛋白溶解于5ml氯化鈉溶液，制備示意圖見圖1，牛血清白蛋白濃度與納米微球直徑的