用于防治煙草青枯病的解淀粉芽孢桿菌b011及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治煙草青枯病的解 淀粉芽孢桿菌B011及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌[Ralstoniasolanacearum(E.F.Smith)]引起的一 種主要從根部侵入的土傳病害，煙草青枯病病菌主要在土壤中及遺落土中的病株殘體上越 冬，通過根莖的傷口或次生根的根冠進入木質(zhì)部，然后在整個維管束蔓延，引起嚴(yán)重的萎蔫 最終導(dǎo)致煙草枯萎死亡。該病在我國南方煙區(qū)普遍發(fā)生，連作地?zé)煵萸嗫莶“l(fā)生較嚴(yán)重，對 煙草生產(chǎn)具有很大威脅。
[0003] 由于煙草青枯病為土傳性細菌病害，化學(xué)農(nóng)藥在大田施用的過程中表層土壤對 其進行吸附影響了其防治效果，目前尚無防治煙草青枯病的特效藥劑。由于青枯病主要通 過土壤傳播，其傳播途徑隱蔽，長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥易使病菌產(chǎn)生抗藥性和造成環(huán)境污 染。隨著人類環(huán)保意識增強，綠色防控?zé)煵莶∠x害日益引起人們的重視，挖掘有效的生防菌 資源并基于其開發(fā)和利用生物防治技術(shù)已成為目前防治煙草青枯病的重點和熱點。
[0004] 近些年來，人們開始利用拮抗細菌對植物病蟲害進行生物防治，"以菌治菌"的防 治模式也逐漸被大家所接受。其中內(nèi)生菌以其獨特的內(nèi)生性而作為生防菌優(yōu)勢更為顯著。 內(nèi)生細菌廣泛分布于植物體內(nèi)，是集生物農(nóng)藥與生物肥料等多方面優(yōu)勢于一體的天然資源 菌株，具有廣闊的理論研宄價值與開發(fā)應(yīng)用前景。挖掘能有效防治煙草青枯病的內(nèi)生細菌 菌株，對于防治煙草青枯病均有重要的意義。如中國專利（專利申請?zhí)枮?01010595753. 3) 公開的"一種防治煙草青枯病的方法"，包括：青枯菌的培養(yǎng)與純化：取青枯病煙草葉脈，用 無菌水浸泡，在培養(yǎng)基上篩選，選取流動性好的單菌落繼續(xù)培養(yǎng)，保存純化的青枯菌；噬菌 體的篩選：取發(fā)生煙草青枯病的植煙土壤，過篩，去雜；取小顆粒用無菌水浸泡，離心后取 上清液過濾，取濾液與青枯菌液共同培養(yǎng)，保存篩選的噬菌體；噬菌體富集培養(yǎng)、收集：在 三角瓶中加入培養(yǎng)基和含青枯菌的無菌水，震蕩培養(yǎng)后，再加入含噬菌體的無菌水，繼續(xù)培 養(yǎng)；離心培養(yǎng)液，取上清液，過濾，濾液備用；牙簽用無菌水浸泡，沖洗、滅菌后烘干，冷卻至 室溫，置于濾液中浸泡，取出后分裝保存?zhèn)溆?；煙草移栽后，用該牙簽插于旺長時期煙草植 株莖基部，防治煙草青枯病。又如中國專利（專利申請?zhí)枮?01310046171. 3)公開的"防治 煙草青枯病拮抗菌及其應(yīng)用"，該拮抗菌為蠟狀芽孢桿菌（BacillusCereuS)QJ-l和黑曲霉 (Aspergillusniger)Ty-3 ;其中，QJ-1保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中 國武漢武漢大學(xué)，保藏日期：2012年7月5日，保藏號：CCTCCN0:M2012271 ;Ty-3保藏單位： 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為：2011年7月8日，保 藏號：CCTCCN0:M2011241。本發(fā)明的拮抗菌蠟狀芽孢桿菌QJ-1和黑曲霉Ty-3組合可制成菌 劑，將菌劑與有機物料發(fā)酵制成的微生物有機肥能提供有A效營養(yǎng)和功能菌，有效的防治 煙草青枯病。還有中國專利（專利申請?zhí)枮?01210338294.X)公開的"防治煙草青枯病拮 抗菌及其應(yīng)用"，所用的生防微生物為煙草賴氨酸芽孢桿菌LysinibacillustobaccocumKpa 菌株，該菌株2012年05月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號：CGMCCNo. 6161 ;該微生物通過產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制煙草青枯病菌的生長，且在煙草 根際有很好的定殖能力，是一種具有工業(yè)化生產(chǎn)前景的菌株。菌劑為Kpa菌株可濕性粉劑， 它對煙草青枯病菌有很好的防治效果，能用于漂浮育苗基質(zhì)處理，移栽期和成熟期；利用 Kpa菌株制備的Kpa菌株可濕性粉劑具有成本低、防效高、無殘留、對人畜安全的特點，是煙 草農(nóng)業(yè)種植中防治青枯病菌的高效生物農(nóng)藥；該發(fā)明為煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中青枯病的防治提供 了一種具有較好防治效果的生防微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種對煙草青枯病有較好拮抗作用的內(nèi)生細菌，該內(nèi)生細菌 對環(huán)境安全性好，且易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是提供一種用于防治煙草青枯病的解 淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)B011，該解淀粉芽孢桿菌B011的活體純培 養(yǎng)已于2014年11月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）（地址：武漢市武 昌珞珈山，郵政編碼 430072,電話：027-68752319)，保藏號：CCTCCNO:M2014576。
[0007] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的分離方法，其分離步驟如下：
[0008](-)、取樣：在已有煙草青枯病發(fā)生的煙田中，選取仍然生長健康的煙株樣品，洗凈， 剪下主根和側(cè)根進行表面消毒，得消毒樣品，備用；
[0009] (二)、研磨：將備用的消毒樣品0. 05-0. 15g置于滅過菌的研缽中，加入5-15ml無菌 水進行研磨，得研磨液，備用；
[0010] ㈢、離心：取備用的研磨液0. 5-1. 5ml靜置20-40min，在2-6°C下離心處理，得離心 后的上清液，備用；
[0011] (四)、純化：將備用的上清液用無菌水KT1~1(T7梯度稀釋后，在NA培養(yǎng)基上采用 涂布平板法，待分離平皿上菌落長出后，挑取形態(tài)不同的單菌落在相應(yīng)的空白NA培養(yǎng)基平 板上進行劃線純化，并在26-30°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)30-50h，得純化菌株，備用；
[0012] (1)、篩選：將備用的純化菌株接種在預(yù)先混有標(biāo)準(zhǔn)煙草青枯菌株（R.solanacearum GMI1000)(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室提供，下同）的NA培養(yǎng)基平板上，采用菌落對 峙法，根據(jù)抑菌圈的大小逐一篩選（即：優(yōu)先選取抑菌圈最大的菌落），即得解淀粉芽孢桿 菌B011。
[0013] 上述篩選方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法。
[0014] 所述NA培養(yǎng)基的配方為：
[0015] 牛肉膏2-5g 葡萄糖5-15g 蛋白胨3-7g
[0016] 氯化鈉 3-5g 瓊脂 15-20g;
[0017] 其配制方法為：
[0018] 將上述原料加水，定容至1L，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH值至6. 0~8. 0,加熱后分裝 三角瓶（250mL瓶，裝100mL液），在115-130°C滅菌15-30min，即得NA培養(yǎng)基（由于添加有 瓊脂，故冷卻后的NA培養(yǎng)基呈固態(tài)狀）。
[0019] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對青枯雷爾氏菌有拮抗作用。
[0020] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對煙草黑脛病菌有拮抗作用。
[0021] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對煙草赤星病菌有拮抗作用。
[0022] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對辣椒炭疽病菌有拮抗作用。
[0023] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對辣椒疫霉病菌有拮抗作用。
[0024] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對西瓜灰霉病菌有拮抗作用。
[0025] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對柑橘炭疽病菌有拮抗作用。
[0026] 所述解淀粉芽孢桿菌B011的應(yīng)用，對稻瘟病菌有拮抗作用。
[0027] 所述解淀粉芽孢桿菌B011菌株的形態(tài)特征鑒定：該解淀粉芽孢桿菌B011菌株在 NA培養(yǎng)基上呈灰白色，不透明，表面干燥皺縮，邊緣不規(guī)則，具有較強的粘附性，革蘭氏染色 呈陽性，周生鞭毛，有芽孢，呈桿狀；該菌株既能在培養(yǎng)基表面生長又能沿穿刺線生長，為兼 性厭氧型細菌；能產(chǎn)生過氧化氫酶和淀粉水解酶，分解明膠和蛋白胨中的色氨酸，但不能分 解含硫的有機硫化物，通過對葡萄糖的代謝產(chǎn)生大量酸，使培養(yǎng)液pH降到4. 2以下；可還原 培養(yǎng)基中的硝酸鹽離子。根據(jù)對該解淀粉芽孢桿菌B011菌株的形態(tài)觀察并結(jié)合生理生化 的結(jié)果，初步認定該解淀粉芽孢桿菌B011菌株為芽孢桿菌（Bacillus)。
[0028] 所述解淀粉芽孢桿菌BO11菌株分子鑒定：提取解淀粉芽孢桿菌BO11的總DNA，將 所提取的樣品基因組DNA容易稀釋作為模板進行PCR擴增，PCR擴增采用細菌通用引物對， 由上海生物工程有限公司合成：正向引物序列27F5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引 物序列1492R5' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。以解淀粉芽孢桿菌B011的基因組DNA為模 板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增后，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條約1. 5kb特異性片段。將回 收后的PCR產(chǎn)物送到上海生物工程有限公司進行測序后，將測出序列提交到NCBI進行系列 比對。通過比對發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌B011的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫中已有的解淀粉芽孢 桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)的 16SrDNA序列同源性均高達 100%。米用MEGA5.0 軟件，通過N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)特征，將解淀粉芽孢桿菌B011確定為淀粉芽孢 桿菌Bacillusamyloliquefaciens。
[0029] 本解淀粉芽孢桿菌B011對煙草青枯病菌（即：青枯雷爾氏菌）的抑制作用：本解 淀粉芽孢桿菌B011對煙草青枯病菌在平板對峙培養(yǎng)過程中有很強的抑制作用，本解淀粉 芽孢桿菌B011在NA液體培養(yǎng)基（配方即為前面所述的NA培養(yǎng)基，NA液體培養(yǎng)基與NA培養(yǎng) 基的區(qū)別在于：NA液體培養(yǎng)基中不加瓊脂，下同）的發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑菌圈（其 中孔徑為11mm)直徑達到了 31. 5_，是內(nèi)生詰抗菌中的優(yōu)勢菌種。
[0030] 本解淀粉芽孢桿菌B011對煙草青枯病的防治效果：煙草青枯病是一種典型的土 傳性根莖類病害，病原菌主要從根部侵入寄主。本發(fā)明針對病原菌的侵入途徑，利用本解淀 粉芽孢桿菌B011在NA液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液進行灌根處理，獲得了好的防治效果。本解淀 粉芽孢桿菌B011在NA液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液的田間小區(qū)防治效果分別為40. 49%，較目前使 用的化學(xué)藥劑72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP在防治煙草青枯病上更具優(yōu)勢。
[0031] 本解淀粉芽孢桿菌B011的最佳發(fā)酵條件：菌株發(fā)酵條件單因素測定表明，本解淀 粉芽孢桿菌B011的生長和抑制煙草青枯病菌的拮抗物質(zhì)產(chǎn)生的最適單因素條件分別是： 牛肉膏3. 0g/L、葡萄糖8. 0g/L、蛋白胨5. 0g/L、氯化鈉4. 0g/L、發(fā)酵溫度