皮膚纖維母細(xì)胞制劑及其制備方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及皮膚纖維母細(xì)胞制劑及其制備方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程。纖維母細(xì)胞是這一生物過程中的主要修 復(fù)細(xì)胞之一。皮膚纖維母細(xì)胞能夠大量合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白等多種細(xì)胞 外成分，在傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)等方面具有廣泛和明顯的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。纖維 母細(xì)胞還能夠維持各種生長因子、細(xì)胞素、基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子的 合成與分解平衡；被認(rèn)為是創(chuàng)傷修復(fù)的工程師、建筑者和管理員。了解與控制纖維母細(xì)胞的 生物學(xué)行為是促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)、創(chuàng)傷愈合、預(yù)防瘢痕形成的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。
[0003] 目前流通于市面的燒燙傷皮膚再生修復(fù)膏。該燙傷膏在中草藥高效有機(jī)成分提純 基礎(chǔ)上，添加了成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)，從而在具有抗感染，收斂結(jié)痂，減少創(chuàng)面滲液的 基礎(chǔ)上增加了促進(jìn)上皮細(xì)胞生長，促進(jìn)壞死組織脫落，減輕瘢痕組織增生的作用。
[0004] 以上所提及的燒燙傷皮膚再生修復(fù)膏雖然比傳統(tǒng)藥物更好的解決了對燒燙傷治 療時間長、易感染、愈后留有疤痕等問題。但是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)在常溫下容易被 降解，難以保持原有的生物活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供皮膚纖維母細(xì)胞制劑及其制備方法、應(yīng)用。纖維母細(xì)胞制 成活細(xì)胞制劑作用于供體真皮層，很好地克服了上述技術(shù)問題，纖維母細(xì)胞能夠馬上分泌 出成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)，并且保持很高的活性，在促進(jìn)皮膚修復(fù)的層面上效果更為明 顯，而且無任何毒副作用，安全可靠。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 本發(fā)明提供了一種皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟1 :獲得皮膚纖維母細(xì)胞，培養(yǎng)；
[0010] 步驟2 :待細(xì)胞爬出70%以上時，對貼壁細(xì)胞消化、終止消化、重懸、計(jì)數(shù)、接種培 養(yǎng)，獲得纖維母細(xì)胞；
[0011] 步驟3 :消化纖維母細(xì)胞，終止消化，離心，棄上清，洗絳，收集沉淀重懸，獲得皮膚 纖維母細(xì)胞制劑。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟1所述 培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基和雙抗培養(yǎng)；所述完全培養(yǎng)基包括高糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS;所述 雙抗為青霉素100U/mL和鏈霉素100yg/mL;
[0013] 所述皮膚纖維母細(xì)胞接種培養(yǎng)密度為5~10X105cell/mL。
[0014] 所述雙抗的濃度為1 %。
[0015] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟2所述 消化為采用0. 25%胰蛋白酶消化2~3min。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟2所述 終止消化采用完全培養(yǎng)基，所述完全培養(yǎng)基包括高糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟3所 述消化采用胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶的酶活為50萬U/g;所述胰蛋白酶溶液的濃度為 0. 25 %，所述加入胰蛋白酶溶液的體積為淹沒過纖維母細(xì)胞。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟3所述 消化的溫度為37°C，所述消化的時間為2~3min。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟3所述 離心為 1000rpm/min離心 5min。
[0020] 作為優(yōu)選，洗滌采用生理鹽水洗滌。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法中步驟3所述 重懸采用生理鹽水和白蛋白重懸。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法獲得的皮膚纖維母細(xì)胞制 劑。
[0023] 纖維母細(xì)胞不僅可以合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白等成分，還可以分泌一些重 要的細(xì)胞生長因子如纖維母細(xì)胞生長因子（FGF)，并保持著較高的活性，刺激皮膚肉芽組織 的形成和促進(jìn)肉芽組織的上皮化，從而縮短創(chuàng)傷的愈合時間以及減少疤痕的形成。而且是 自體的細(xì)胞，不存在排斥性，安全可靠。
[0024] 本發(fā)明還提供了所述皮膚纖維母細(xì)胞制劑在制備皮膚再生修復(fù)的藥物、化妝品、 食品、保健品中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供一種皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備方法及制得的皮膚纖維母細(xì)胞制劑， 以及皮膚纖維母細(xì)胞制劑在制備促進(jìn)皮膚修復(fù)藥物、化妝品、食品、保健品中的應(yīng)用。皮膚 纖維母細(xì)胞制劑的制備方法流程如圖1所示，制得的纖維母細(xì)胞制劑作用于供體真皮層， 很好地克服了上述技術(shù)問題，纖維母細(xì)胞能夠馬上分泌出成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)，并 且保持很高的活性，在促進(jìn)皮膚修復(fù)的層面上效果更為明顯，而且無任何毒副作用，安全可 與巨〇
[0026] 1、纖維母細(xì)胞來源廣泛，易于獲取。
[0027] 2、纖維母細(xì)胞能夠合成大量膠原蛋白和彈性蛋白，有利于皮膚修復(fù)。
[0028] 3、本發(fā)明把纖維母細(xì)胞作用于供體真皮層，不具有排斥反應(yīng)。
[0029] 4、本發(fā)明把纖維母細(xì)胞作用于供體真皮層，能夠分泌出具有高活性、高穩(wěn)定性的 成纖維細(xì)胞生長因子，促進(jìn)受損皮膚的康復(fù)愈合，修復(fù)效果顯著提高（P< 0. 05)。
【附圖說明】
[0030] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0031] 圖1示本發(fā)明提供的皮膚纖維母細(xì)胞制劑的制備流程；
[0032] 圖2示顯微鏡下觀察本發(fā)明制得的皮膚纖維母細(xì)胞制劑中細(xì)胞生長狀態(tài)；放大倍 數(shù)為（100X);
[0033] 圖3示流式細(xì)胞儀檢測P6代細(xì)胞表面標(biāo)記物（Vimentin，CK15)表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明公開了皮膚纖維母細(xì)胞制劑及其制備方法、應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借 鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的