禽呼腸孤病毒σA蛋白及其相關生物材料的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種禽呼腸孤病毒〇A蛋白及其相關生物材料的應用，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 真核細胞內(nèi)存在多條信號轉(zhuǎn)導通路，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)信號通路在眾多 信號通路中發(fā)揮十分重要的作用，可通過其下游效應分子蛋白激酶B(Akt)來調(diào)控多種細 胞功能，如細胞增殖與分化、抑制細胞凋亡等，病毒感染通常會干擾該信號通路。PI3K是 由催化亞基pll〇和調(diào)節(jié)亞基P85所組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重 活性。研宄表明，病毒蛋白或細胞蛋白通過PXXP(P為脯氨酸，X為任意氨基酸）或YXXXM/ YXXM(Y為酪氨酸，X為任意氨基酸，M為蛋氨酸）基序與P85結合，從而激活PI3K/Akt信號 通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表達量升高，實現(xiàn)抑制細胞凋亡的發(fā)生。
[0003] 大量的研宄資料表明，當病毒侵入宿主細胞后，被感染的細胞能被宿主的免疫系 統(tǒng)識別，并通過誘導細胞凋亡而對感染了病毒的細胞加以清除，從而限制病毒在細胞內(nèi)的 復制及傳播。但是在選擇壓力的作用下，許多病毒已經(jīng)進化出某些可以逃避細胞凋亡的機 制，使得病毒在宿主細胞死亡之前能完成其復制周期，這些對抗措施通常是由病毒蛋白來 介導的。許多病毒通過自身的某些蛋白與PI3K的P85調(diào)節(jié)亞基結合，進而激活PI3K/Akt 信號通路，促進P-Akt的轉(zhuǎn)錄表達。P-Akt表達量的升高，可磷酸化許多信號蛋白，并通過這 些蛋白調(diào)節(jié)與細胞生存、增殖、迀移、分化和凋亡有關的多條下游信號轉(zhuǎn)導通路，如通過抑 制促凋亡蛋白的活性，從而抑制凋亡刺激信號誘發(fā)的細胞凋亡，還可通過控制凋亡調(diào)芐基 因的表達而抑制細胞調(diào)亡。
[0004]Labrada和Shih等的研宄表明，禽呼腸孤病毒（Avianreovirus，ARV)引起感染細 胞出現(xiàn)細胞凋亡是發(fā)生在其感染的中后期。Lin等使用ARV感染Vero細胞后，通過Western blot檢測P-Akt的表達量，從病毒的角度證實了ARV感染的早期激活了PI3K/Akt信號通 路，從而抑制了感染細胞的凋亡，以有利于ARV完成其復制周期。ARV怎樣來啟動PI3K/Akt 信號通路，實現(xiàn)抑制感染細胞的凋亡，目前還不清楚，找出能激活PI3K/Akt信號通路的ARV 物質(zhì)，從細胞信號轉(zhuǎn)導的角度揭示ARV的分子致病機制，可以為尋找抗ARV藥物作用靶點提 供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是確定激活PI3K/Akt信號通路的ARV蛋白，進而可將 其作為抗ARV藥物的作用靶點。
[0006] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明提供禽呼腸孤病毒的〇A蛋白或其相關生物材料 在制備提高細胞內(nèi)磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表達量的產(chǎn)品中的應用；
[0007] 所述禽呼腸孤病毒的〇A蛋白的相關生物材料，為下述B1)至B9)中的任一種：
[0008] B1)編碼所述禽呼腸孤病毒的〇A蛋白的核酸分子；
[0009] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0010]B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0011]B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0012]B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0013] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0014]B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0015]B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0016]B9)表達禽呼腸孤病毒〇A蛋白的重組細胞。
[0017] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供禽呼腸孤病毒的〇A蛋白或其相關的生物 材料在制備激活細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路產(chǎn)品中的應用；
[0018] 所述禽呼腸孤病毒的〇A蛋白的相關生物材料，為下述B1)至B9)中的任一種：
[0019]B1)編碼所述禽呼腸孤病毒的〇A蛋白的核酸分子；
[0020] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0021]B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0022] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0023]B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0024]B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0025] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0026]B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0027]B9)表達禽呼腸孤病毒〇A蛋白的重組細胞。
[0028] 上述任一所述的生物材料中，B1)所述的核酸分子為如下1)或2)或3)所示的核 酸分子，即〇A基因：
[0029] 1)核苷酸序列是SEQIDNo. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0030] 2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述〇A蛋白的 cDNA分子或基因組DNA分子；
[0031] 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述〇A蛋白的cDNA 分子或基因組DNA分子；
[0032] 其中，SEQIDNo. 2由1251個核苷酸組成，SEQIDNo. 2的核苷酸編碼SEQIDNo. 1 所示的氨基酸序列；
[0033] 所述〇A蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
[0034] 本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼〇A蛋白的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明 人工合成的編碼〇A蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼〇A蛋白 且具有相同功能的蛋白質(zhì)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列；
[0035] 這里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
[0036] 上述生物材料中，所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次 15min;
[0037] 上述75%或75%以上同一性，可為80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0038] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼禽呼腸孤病毒的〇A蛋白的核酸分子的表 達盒（〇A基因表達盒），是指能夠在宿主細胞中表達〇A蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟 動〇A基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止〇A基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可 包括增強子序列。
[0039] 上述生物材料中，可用現(xiàn)有的表達載體構建含有所述〇A基因表達盒的重組載 體。
[0040] 上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0041] 上述生物材料中，所述的微生物可為原核微生物或真核微生物；所述原核微生物 可為細菌；所述細菌可為埃希氏菌屬細菌；所述埃希氏菌屬細菌可為大腸桿菌；所述真核 微生物可為藻類、真菌、原生動物；所述真菌可為單細胞真菌；所述單細胞真菌可為酵母 菌。
[0042] 上述生物材料中，所述重組載體為將pcAGEN的XhoI和NotI位點間的DNA替換 為SEQIDNo. 2所示的DNA，保持pcAGEN的其余序列不變，得到的表達所述禽呼腸孤病毒的 〇A蛋白的重組表達載體。
[0043] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供表達禽呼腸孤病毒〇A蛋白的重組細胞在 制備篩選抑制感染禽呼腸孤病毒的細胞中禽呼腸孤病毒〇A蛋白活性的物質(zhì)的細胞模型 中的應用；
[0044] 本文中所述表達禽呼腸孤病毒〇A蛋白的重組細胞可為表達禽呼腸孤病毒〇A蛋 白的重組哺乳動物細胞，如表達禽呼腸孤病毒〇A蛋白的重組Vero細胞。
[0045] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A蛋白活性的物質(zhì)在 制備預防和/或治療禽呼腸孤病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應用。
[0046] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A蛋白活性的物質(zhì)在 制備抑制禽呼腸孤病毒的生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應用。
[0047] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A蛋白表達的物質(zhì)在 制備預防和/或治療禽呼腸孤病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應用。
[0048] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A蛋白表達的物質(zhì)在 制備抑制禽呼腸孤病毒的生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應用。
[0049] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A基因表達的物質(zhì)在 制備預防和/或治療禽呼腸孤病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應用。
[0050] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供抑制禽呼腸孤病毒〇A基因表達的物質(zhì)在 制備抑制禽呼腸孤病毒的生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應用。
[0051] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供以禽呼腸孤病毒〇A蛋白為作用靶點的物 質(zhì)在制備預防和/或治療禽呼腸孤病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應用；
[0052]或，
[0053] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供以禽呼腸孤病毒〇A蛋白為作用靶點的物 質(zhì)在制備抑制禽呼腸孤病毒的生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應用；
[0054]或，
[0055] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供以禽呼腸孤病毒〇A基因為作用靶點的物 質(zhì)在制備預防和/或治療禽呼腸孤病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應用；
[0056]或，
[0057] 為了解決以上技術問題，本發(fā)明還提供以禽呼腸孤病毒〇A基因為作用靶點的物 質(zhì)在制備抑制禽呼腸孤病毒的生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應用。
[0058] 上述任一所述的應用中，所述〇A蛋白的氨基酸序