一種高活力微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種高活力微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法，尤其涉及一種中空纖維濃縮培養(yǎng)結(jié)合低溫噴霧制備高活力乳酸菌發(fā)酵劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌是發(fā)酵食品最常用的發(fā)酵劑，也是目前商業(yè)上使用最廣泛的發(fā)酵劑。傳統(tǒng)液體發(fā)酵劑需要多次活化和擴培，工藝繁瑣、容易增加噬菌體污染機會，不能滿足生產(chǎn)需求，直投式發(fā)酵劑正逐步替代傳統(tǒng)液體發(fā)酵劑。
[0003]高密度培養(yǎng)和菌體的富集濃縮是直投式發(fā)酵菌劑制備過程中重要的環(huán)節(jié)，單位活菌數(shù)達到10ncfU/ml是保證直投式發(fā)酵劑活力的關(guān)鍵技術(shù)指標。傳統(tǒng)的高密度培養(yǎng)方法包括緩沖鹽法、化學中和法、膜滲析法和細胞循環(huán)培養(yǎng)法，這些方法在一定范圍內(nèi)可以解除部分代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用。但是，但由于制備工藝的缺陷，如工藝環(huán)節(jié)無法密閉偶聯(lián)、或者溫度過高、過低，這都造成發(fā)酵劑單位體積菌密度高，而單位體積的活菌數(shù)較低，這對于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)來說仍是難以滿足生產(chǎn)需求的。因此，如何獲得單位活菌數(shù)高的高活力發(fā)酵劑技術(shù)是提高直投式發(fā)酵劑品質(zhì)的更高要求。
[0004]另外，在直投式發(fā)酵劑制備過程中，高密度培養(yǎng)和濃縮技術(shù)之后，需要對高密度菌體進行干燥。目前直投式發(fā)酵劑干燥的方法主要采用噴霧干燥和冷凍干燥，噴霧干燥常用的是高溫噴霧干燥，由于出口溫度較高，使得一些耐熱性較差的菌株在噴霧干燥中損傷，而低溫冷凍干燥方式由于溫度過低，對菌株產(chǎn)生低溫脅迫，同樣造成濃縮過的高密度菌體活力降低，嚴重影響了直投式發(fā)酵劑的單位菌活力，滿足不了直投式發(fā)酵劑的生產(chǎn)需求。
[0005]目前已報道的直投式發(fā)酵劑的制備工藝，還未見將中空纖維濃縮偶聯(lián)低溫噴霧干燥技術(shù)制備直投式發(fā)酵劑的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種中空纖維濃縮結(jié)合低溫噴霧干燥制備高活力乳酸菌發(fā)酵劑的方法，可以獲得單位活菌數(shù)可達111?10 12CfVmL的乳酸菌發(fā)酵劑。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種高活力微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法，包括“乳酸菌高密度培養(yǎng)+中空纖維濃縮進行在線連續(xù)過濾濃縮培養(yǎng)+低溫噴霧干燥方法”制備微囊化乳酸菌發(fā)酵劑；具體包括以下步驟:
[0009](I)、乳酸菌接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，乳酸菌的接種量為I?2% (v/v體積百分比)，培養(yǎng)溫度為37?42°C，pH6.2?6.4，培養(yǎng)至單位菌落數(shù)達到107cfu/mL以上；
[0010](2)、將步驟⑴制得的菌液進行中空纖維膜過濾濃縮得到濃縮菌液，過濾除去代謝產(chǎn)生的對乳酸菌生長具有反饋抑制的乳酸、醋酸第物質(zhì)，濃縮溫度為25°C ±5°C，中空纖維膜孔徑為0.1 μ m，膜過濾壓力為0.04?0.06MPa，膜過濾流速250?350L/ (h.m2)；
[0011](3)、往步驟⑵制得的濃縮菌液中注入新鮮滅菌的培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基的體積為步驟(I)中培養(yǎng)基體積的1/3?1/2，培養(yǎng)溫度為37?42°C，pH6.2?6.4，培養(yǎng)至單位菌落數(shù)達到109cfu/mL以上；
[0012](4)、步驟(3)制得的菌液按照步驟(2)中空纖維膜過濾濃縮方法過濾濃縮2?3次，獲得單位菌落數(shù)達到10ncfu/mL以上的濃縮菌液；
[0013](5)、往濃縮菌液中加入明膠、蔗糖和乳清蛋白作為壁材，壁材在濃縮菌液中的濃度分別為:1.5?2.5%明膠、2.5?3.5%蔗糖、1.5?2.5%乳清蛋白(w/v，即質(zhì)量/菌液體積)；進行噴霧干燥，噴霧條件為:進風口溫度為60?65°C，進樣速度為17?18mL/min，制得微囊化乳酸菌發(fā)酵劑。
[0014]本發(fā)明中，所述的乳酸菌為本領(lǐng)域常規(guī)所述的乳酸菌；按照培養(yǎng)的具體乳酸菌菌種進行調(diào)整培養(yǎng)基。乳酸菌在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。所述的乳酸菌采用沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei subsp.Sakei)時，所述的培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸銅0.25g/L，吐溫801mL/L，麥芽糖 20g/L，緩沖體系為 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4 (pH6.2 ?6.4)。
[0015]步驟(2)中，對菌液濃縮之前，需首先對中空纖維膜進行清洗殺菌，殺菌合格后，再對菌液進行濃縮培養(yǎng)，濃縮過程中中空纖維膜處于無菌狀態(tài)。清洗殺菌的步驟為:酸洗、水洗至中性、堿洗、水洗至中性、酸洗、水洗至中性；具體為:
[0016](a)、使用檸檬酸配制的pH為I?3的酸清洗液循環(huán)酸洗2次；
[0017](b)、使用無菌水循環(huán)水洗至中性；
[0018](c)、使用碳酸鈉配制的pH為10?12的堿清洗液循環(huán)堿洗2次；
[0019](d)、使用無菌水循環(huán)水洗至中性；
[0020](a)、使用檸檬酸配制的pH為I?3的酸清洗液循環(huán)酸洗2次；
[0021](b)、使用無菌水循環(huán)水洗至中性，取最后一次水洗后的溶液待用。
[0022]中空纖維膜的清洗殺菌后，將待用溶液吸取200 UL涂布到平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上，置于37°C下培養(yǎng)24h后計數(shù)，無菌落生長，表明殺菌效果良好，可使用。
[0023]所述的中空纖維膜優(yōu)選為PVDF中空纖維膜。
[0024]步驟(5)中，壁材在濃縮菌液中的濃度分別優(yōu)選為:2%明膠、3%蔗糖、2%乳清蛋白。
[0025]本發(fā)明所述的微囊化乳酸菌發(fā)酵劑中單位活菌數(shù)達到I X 111?1X10 12cfu/mL,所述的微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的體積粒徑大小為5?60 μ m。
[0026]本發(fā)明的有益效果:
[0027]本發(fā)明方法將中空纖維膜與生物反應(yīng)器組合，進行乳酸菌高密度培養(yǎng)和濃縮，然后偶聯(lián)低溫噴霧干燥，制備高效直投式乳酸菌發(fā)酵劑的工藝技術(shù)。本發(fā)明方法由于采用了中空纖維濃縮技術(shù)可以實現(xiàn)在線連續(xù)過濾濃縮培養(yǎng)，避免了菌體轉(zhuǎn)移帶來的污染，同時采用低溫噴霧干燥技術(shù)，對已濃縮的高密度菌體進行有效保護，將核心物質(zhì)包裹在一個微小的膠囊中，與環(huán)境隔離，減少外界環(huán)境的影響，保持其高效活力，獲得單位活菌數(shù)可達I X 111 ?1X10 12cfu/mL。
[0028]本發(fā)明方法制得的微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的體積粒徑大小為5?60 μ m，微囊粒徑大小符合制粒要求。避免了當微膠囊粒徑小于5 μπι時，因布朗運動加劇而不容易收集；當粒徑大于300 μπι時，其表面摩擦系數(shù)會突然下降而失去微膠囊作用。
【附圖說明】
[0029]圖1是本發(fā)明方法的工藝流程圖；
[0030]圖2是本發(fā)明乳酸菌發(fā)酵劑的顯微結(jié)構(gòu)(bar = 50 μπι)；
[0031]圖3是本發(fā)明乳酸菌發(fā)酵劑的顯微結(jié)構(gòu)(bar = 5 μπι)；
[0032]圖4是本發(fā)明乳酸菌發(fā)酵劑的顯微結(jié)構(gòu)(bar = 2 μπι)；
[0033]圖5是本發(fā)明乳酸菌發(fā)酵劑的微囊粒徑分析。
【具體實施方式】
[0034]通過【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步