一種魚精蛋白專用編碼基因及其應(yīng)用
【專利說明】一種魚精蛋白專用編碼基因及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種魚精蛋白專用編碼基因及其利用該 編碼基因制備魚精蛋白的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 鮭魚又稱三文魚，是深海魚類的一種，為常用的食品之一，中國產(chǎn)的大馬哈魚便是 鮭魚的一種。鮭魚在淡水環(huán)境下出生，之后移到海水生長，又會回到淡水繁殖。成熟雄魚的 精巢組織稱魚精，因具有異味，多被廢棄或作廢料。但魚精中含有魚精蛋白（Protamine)，魚 精蛋白也稱精蛋白，是一種堿性蛋白質(zhì)，主要存在于魚類（鮭魚、鯡魚、鱒魚）的成熟精子細 胞中，與DNA緊密結(jié)合在一起，以所謂的核精蛋白的形式存在。
[0003] 魚精蛋白相對分子量小，一般由30~50個氨基酸組成，分子中2/3以上的氨 基酸都是精氨酸，等電點在pH10~12,可溶于水和烯酸，加熱不凝固。根據(jù)堿性氨基酸 組成的種類和數(shù)量不同，可將魚精蛋白分為單魚精蛋白（monoprotamine)，雙魚精蛋白 (diprotamine)和三魚精蛋白（triprotamine)3種。其中，單魚精蛋白僅含一種組分精氨 酸，如鮭、鯡和虹鱒精蛋白等；雙魚精蛋白含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸，如鯉精蛋白；三魚 精蛋白含有3種堿性氨基酸，如鰱、舞精蛋白。研宄表明常見魚精蛋白并不是單一組分，它 們通常是由幾種成分組成的混合物，如鯡魚精蛋白經(jīng)離子交換層析后分離出3種成分，且 成分之間彼此非常相似，而紅鱒魚精蛋白則由6種差別極小的成分組成。不同魚種魚精蛋 白在氨基酸組成比例上有很大的差別，但是它們存在很多相似的特征。Yoshiko研宄了 12 種魚類的魚精蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)12種魚精蛋白的N-末端均為精氨酸或丙氨酸，且均含有4個 較長的和2個較短的精氨酸簇，分別被Thr或Ser、Gly-Gly、Pro-lie或Val-Val特征性殘 基分隔開。
[0004] 在動物精細胞中還存在著一種與魚精蛋白結(jié)構(gòu)非常相似的蛋白質(zhì)一組蛋白，組蛋 白也是一種堿性蛋白質(zhì)，與細胞中DNA結(jié)合起著維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，其分子結(jié)構(gòu)比魚 精蛋白復(fù)雜，通常由H1、H2A、H2B、H3、H4五種組分組成。在精子細胞成熟階段，魚精蛋白逐 步代替組蛋白而與DNA結(jié)合使DNA處于穩(wěn)定且不轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)。國外學(xué)者的研宄表明魚精蛋 白的形成經(jīng)歷了組蛋白-中間蛋白-精蛋白的轉(zhuǎn)化過程，在此過程中，中間蛋白可能存在 TP1和TP2兩種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，因而可以解釋魚精蛋白含有兩種或多種組分；同時，還發(fā)現(xiàn)不 同成熟度和成熟階段的魚類精巢中精蛋白成分和含量的不同，完全成熟的魚類精巢更適合 于提取魚精蛋白，而不成熟或未完全成熟的魚精蛋白中雜蛋白較多，這些雜蛋白或許是不 成熟的魚精中未完全轉(zhuǎn)變成魚精蛋白的組蛋白或中間蛋白。因此，提取魚精蛋白時考慮魚 的性成熟程度是很有必要的。
[0005] 自1937年McClean等報道了魚精蛋白能夠抑制傷寒埃氏桿菌的生長、Miller等 發(fā)現(xiàn)魚精蛋白能夠抑制多種好氧菌和厭氧菌的呼吸代謝從而影響其成長繁殖之后，魚精蛋 白的抑菌作用才受到人們的廣泛關(guān)注，作為化學(xué)防腐劑的替代品逐漸出現(xiàn)在食品添加劑行 列。
[0006] 魚精蛋白的一個重要特點就是具有良好的抑菌活性，它能明顯的抑制革蘭氏陽性 (G+)、霉菌、酵母的生長，對巨大芽孢桿菌、枯草桿菌等也有一定抑制作用。起初研宄人員認 為，魚精蛋白只對革蘭氏陽性菌抑制作用明顯，對革蘭氏陰性菌（G-)、霉菌及酵母幾乎沒有 抑制作用，但后來研宄的結(jié)論表明并非如此，認為魚精蛋白的抑菌性與革蘭氏反應(yīng)沒有直 接關(guān)系。也有研宄表明鮭精蛋白對G+和G-均具有明顯抑制作用并且對霉菌和酵母抑制作 用更強。魚精蛋白對不同微生物的最低抑菌濃度因菌種的不同有較大差異，比如雖然魚精 蛋白具有較強的抗霉菌作用，但對Walemiasebi、Aspergillus等幾乎沒有作用。
[0007] 魚精蛋白能夠抑制微生物的生長，這引起人們對其抑菌機理的探討。國內(nèi)外學(xué) 者針對于此做了大量研宄，目前存在的理論主要有：一是魚精蛋白作用于微生物的細胞壁 和質(zhì)膜系統(tǒng)；二是該蛋白作用于細胞內(nèi)酶系統(tǒng)或功能蛋白；三是魚精蛋白作用于遺傳物 質(zhì)。Antohi等通過研宄提出了魚精蛋白作用于微生物細胞壁而起抑菌作用這一假設(shè)性論 斷；Arden等認為魚精蛋白通過影響細胞質(zhì)膜的功能而具有抑菌效果；Kashket和Berger 等人的研宄結(jié)果表明魚精蛋白通過影響微生物細胞質(zhì)膜而影響微生物對脯氨酸的吸收； Mishihara的研宄發(fā)現(xiàn)魚精蛋白可以抑制細菌細胞中葡萄糖和氧氣的消耗，認為魚精蛋白 可能是吸附在微生物細胞的表面并破壞細菌細胞質(zhì)膜引起的；也有觀點認為魚精蛋白抗菌 效果是通過對這2個部位（細胞壁和細胞質(zhì)膜）共同作用而產(chǎn)生的疊加效果；魚精蛋白還 可以使細胞喪失積累亮氨酸的能力，阻斷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，直至破壞能量傳導(dǎo)和營養(yǎng) 的攝取，還可降低ATP合成，損害細胞內(nèi)質(zhì)子電動勢的產(chǎn)生能力，從而抑制細胞的新陳代謝 能力；也有研宄表明在半致死濃度時魚精蛋白還可抑制基因轉(zhuǎn)錄。由此可見，對于魚精蛋白 的抑菌機理，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量深入的研宄，觀點不一，抑菌機理宄竟怎樣還有待于進 一步探索和研宄。
[0008] 由于魚精蛋白在抑菌防腐方面以及安全性、穩(wěn)定性和營養(yǎng)性等方面都具有眾多的 優(yōu)勢，魚精蛋白代替化學(xué)防腐劑使用在食品行列有著廣闊的前景。此外，魚精蛋白主要可用 于因注射肝素過量所引起的出血，且無其他藥品可替代，抑制腫瘤生長繁殖，增強肝功能， 促進細胞繁殖發(fā)育。
[0009] 因為利潤低以及魚精蛋白本身的不可替代性，而且鑒于魚精蛋白的原料有季節(jié) 性，原料受自然制約性很強，導(dǎo)致出現(xiàn)供貨緊張的情況。自2011年開始，南京、武漢、南通等 地魚精蛋白紛紛告急，很多心臟病手術(shù)被迫停止。由于魚精蛋白完全是天然成分，具有很高 的安全性，具有安全、無毒、無副作用的優(yōu)點，作為一種新型防腐劑，在食品工業(yè)中具有廣闊 的應(yīng)用前景。我國魚資源豐富，充分開發(fā)魚白資源，變廢為寶，有一定的經(jīng)濟效益和社會效 益，但是直接提取產(chǎn)量有限。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種魚精蛋白專用編碼基因。
[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種利用上述編碼基因制備魚精蛋白 的方法。
[0012] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題之一的：一種魚精蛋白專用編碼基 因，該編碼基因的堿基序列如SEQIDNO: 1所示。
[0013] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題之二的：一種利用上述編碼基因制 備魚精蛋白的方法，其包括如下具體操作：
[0014] (1)將權(quán)利要求1所述編碼基因與載體pET22b連接后轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)，獲得工 程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro;
[0015] (2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro單菌落并接種入含Ampl00yg/ml的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，之后按1:100的體積比轉(zhuǎn)入含AmplOOyg/ml的乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培 養(yǎng)20h，接著于4°C、6000rpm條件下離心20min，然后收集菌體，并置于-80°C下保存；
[0016] (3)將步驟（2)收集到的菌體經(jīng)-80°c和4°C反復(fù)凍融三次裂解菌體，加入破菌液， 且每1克菌體加入10毫升破菌液，并于4°C，10000rpm下離心20min，離心結(jié)束后分別收 集沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接著采用沉淀洗滌液洗滌沉淀兩 次，之后用沉淀溶解液溶解洗滌后的沉淀，得溶解液；將溶解液經(jīng)NiSepharose親和層析 進行純化洗脫，所用洗脫液的組分為0.5MNaCl、20mMNaH2P04、500mMImidazole、8MUrea、 pH= 7. 4,最終洗脫液中的蛋白即為純化后的融合蛋白CYGB-Pro;
[0017] (4)將步驟（3)所得純化后的融合蛋白CYGB-Pro進行CNBr裂解，具體地：將純化 后的融合蛋白CYGB-Pro,置于通風(fēng)櫥中，并于通風(fēng)櫥中加入濃度為0. 2M的濃鹽酸終、終濃 度為50mg/ml的CNBr，避光室溫裂解24h，之后加入等體積的ddH20滅活CNBr;然后采用流 速為3mL/min的G-25分子篩進行脫鹽純化，即得所述魚精蛋白，且脫鹽純化采用的平衡液 和洗脫液均為去離子水。
[0018]進一步地，所述破菌液的組分：0?5MNaCl，2