一個棉花bHLH轉錄因子基因GhFP1及其啟動子的鑒定及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及棉花基因，具體是棉花basic helix-loop-helix (bHLH)家族中的一個 新成員基因GhFPl的表達及功能鑒定，以及其啟動子纖維特異表達活性鑒定，進而應用于 棉纖維品質改良。
【背景技術】
[0002] 棉花是全世界最重要的經(jīng)濟作物之一。依照其基因組構成可分為異源四倍體棉 花（AADD)，以及二倍體棉花（AA)和（DD)。目前種植的棉花主要是異源四倍體棉花（約 占全部棉花種植面積的95%以上），二倍體棉花種植較少。異源四倍體棉花又分為陸地棉 (Gossypiumhirsutum)與海島棉（G.barbadense)。陸地棉原產(chǎn)中美洲，其適應性廣，是目 前種植最多的棉花種，占全部棉花種植面積的90%以上。隨著紡織工業(yè)快速發(fā)展，人民生活 水平不斷提高，紡織工業(yè)及其相關產(chǎn)業(yè)對棉纖維品質的要求愈來愈高。我國棉花產(chǎn)量據(jù)世 界第一位，但棉花纖維品質較差，因此，纖維品質問題已成為制約我國棉花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展 的主要障礙之一。
[0003] 棉纖維是由種皮上突起的細胞產(chǎn)生的，每根纖維都是一個單細胞。而纖維長度是 衡量棉花纖維品質的一個重要指標，因此對調控細胞伸長基因的研宄對于改良棉纖維品質 具有重要意義。
[0004] 植物細胞伸長受到諸多因素的影響，生長素（Auxin)、赤霉素（GA)和油菜素內酯 (BR)等植物激素對細胞伸長具有重要促進作用。在擬南芥中研宄發(fā)現(xiàn)，上述3類激素對于 細胞伸長的調控機制最終都經(jīng)過了一個HLH/bHLH家族轉錄因子相互作用的調控網(wǎng)絡。雖 然還沒有棉纖維發(fā)育中關于HLH/bHLH轉錄因子功能研宄相關的報道，但在對二倍體棉花 的基因組測序中發(fā)現(xiàn)了 200多個HLH/bHLH家族轉錄因子成員，暗示著HLH/bHLH轉錄因子 可能對棉纖維細胞發(fā)育具有重要作用。
[0005] HLH/bHLH家族轉錄因子廣泛存在于真核生物中。該家族蛋白都具有一個約60個 氨基酸組成的bHLH結構域。該結構域又分為2個部分，位于N端的basic區(qū)域以及隨后的 helix-loop-helix (HLH)區(qū)域。Basic區(qū)域一般由15到20個氨基酸殘基組成，該區(qū)域主要 與DNA的結合有關。HLH結構域主要參與蛋白質之間的相互作用來形成同源或異源復合體， 從而發(fā)揮其對下游靶基因的調控作用。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一個參與棉花纖維發(fā)育調控的新基因GhFPl，分析其啟動 子活性，蛋白亞細胞定位和轉錄激活活性，蛋白質間的相互作用及其在轉基因擬南芥和棉 花植株中產(chǎn)生的表型變化，以研宄其功能，為解析纖維細胞伸長的分子機制，改良棉花纖維 的品質提尚新的科學資料。
[0007] 采用比較基因組學和生物信息學等研宄方法，從棉花纖維cDNA文庫中分離鑒定 了一些棉花HLH/bHLH家族基因，并對其中的GhFP1進行了研宄。分析表明，GhFP1cDNA全長 序列為1262bp，如SEQ.ID.No. 1所示，開放閱讀框為1068bp，編碼一個含355氨基酸的bHLH 蛋白質，蛋白質氨基酸序列如SEQ.ID.No. 2所示，分子量為39. 2kDa。
[0008] 利用染色體步移法（genomewalkingPCR)，分離克隆了長度為1061bp的GhFPl 啟動子片段，如SEQ.ID.No. 3所示。將該啟動子GhFPlpro與⑶S報告基因融合，構建了 pBI121-GhFPlpro:⑶S表達載體，轉化棉花。分析了⑶S基因在棉花纖維等組織細胞中的表 達，表明該啟動子在棉纖維發(fā)育過程中有較高的表達活性。
[0009] 為驗證GhFPl基因編碼的bHLH蛋白是否為轉錄因子，我們利用表1中的 GhFPl-ORF-L與GhFPl-ORF-R為引物克隆到了GhFPl的開放閱讀框，構建相關的表達載體， 分析該蛋白的亞細胞定位及轉錄激活活性。構建了pBI121-GhFPl:GFP融合表達載體，轉化 了擬南芥，觀察轉基因擬南芥幼苗的下胚軸，結果顯示GhFPl:GFP融合蛋白定位于細胞核 中。
[0010] 為了分析該蛋白的轉錄激活活性，構建了pGBKT7-GhFPl和pGADI7-GhFPl表達載 體，分別轉化釀酒酵母菌株Y187和AH109,進行劃線及X-gal顯色實驗，結果顯示GhFPl蛋 白具有轉錄激活能力。同時，我們在擬南芥中過量表達了GhFPl蛋白，觀察發(fā)現(xiàn)GhFPl蛋白 的過量表達導致轉基因擬南芥葉片表皮毛形態(tài)發(fā)生了明顯改變，表皮毛體積變大，長度增 加。
[0011] 為進一步研宄GhFPl基因的功能，構建了由棉纖維特異啟動子GhTUA9p(本發(fā)明人 克隆鑒定的纖維特異啟動子，已申請獲得的授權專利ZL2010 1 0028915. 5)驅動的GhFPl 過量表達及RNAi載體，轉化棉花，獲得了轉基因棉花植株。對GhFPl過量表達轉基因棉花 的成熟纖維進行了長度測量，結果顯示過量表達GhFPl增加了棉花成熟纖維的長度。利用 定量RT-PCR分析了轉基因棉花中一些纖維發(fā)育相關基因的表達情況，結果表明油菜素內 酯（BR)受體基因GhBRIl及參與BR合成的基因GhDWF4和Gh(PD的表達上調。離體胚培養(yǎng) 實驗也顯示GhFPl過量表達后，增強了棉纖維發(fā)育過程中對油菜素內酯合成抑制劑（BRZ) 的耐受。以上結果表明，GhFPl基因在棉纖維中的過量表達增加了BR信號，促進棉纖維伸 長發(fā)育。
[0012] 進而分離克隆了BR合成相關基因GhDWF4及GhCPD的啟動子序列，對其進行了分 析，發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子上都含有被bHLH家族轉錄因子識別的E-box (CANNTG)元件。表達純 化了GhFPl蛋白，利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)實驗驗證蛋白與 DNA之間的相互作用，結果表明GhFPl蛋白能夠與這些E-box序列相結合，調控這些基因的 功能表達，從而影響棉纖維伸長發(fā)育。
[0013] 利用酵母雙雜交及pull-down實驗分析了GhFPl蛋白與其他HLH/bHLH家族蛋白 的相互作用。結果顯示GhFPl蛋白自身能形成同源二聚體，也能與其他HLH/bHLH蛋白之間 形成異源二聚體。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0015] 1、提供了一個棉花新基因GhFPl的全長cDNA序列及其編碼的蛋白質序列，分析了 該蛋白的亞細胞定位和轉錄活性，證實了該基因編碼的蛋白屬于HLH/bHLH轉錄因子。
[0016] 2、提供了一個GhFPl基因上游啟動子序列，分析證明該啟動子在棉纖維發(fā)育過程 中有較高的特異表達活性。
[0017] 3、GhFPl基因在擬南芥中的過量表達能促進表皮毛細胞發(fā)育，導致表皮毛增大變 長；在棉花纖維中過量表達GhFPl導致油菜素內酯相關基因表達上調，促進纖維伸長發(fā)育， 成熟棉纖維長度增加。
[0018] 4、棉花HLH/bHLH蛋白之間存在一個相互作用網(wǎng)絡，參與棉纖維的發(fā)育調節(jié)，在棉 纖維伸長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】：
[0019] 圖1.GhFPl基因組織表達、GhFPl蛋白亞細胞定位及轉錄激活分析。
[0020] A.Real-timeRT-PCR分析GhFPl在棉花各組織中的表達（1，根；2,下胚軸；3,子 葉；4,葉；5,花瓣；6,花藥；7胚珠；8, 3DPA纖維；9,OTPA纖維；10, 10DPA纖維；11，12DPA 纖維；12, 15DPA纖維；13, 20DPA纖維）。用表 1 中的GhFPl-RT-L、GhFPl-RT-R、GhUBIl-L 與GhUBIl-R為引物，不同棉花組織cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，最后計算出GhFPl 表達量的相對值。B.GhFPl蛋白的亞細胞定位。箭頭表示GFP熒光信號在細胞核中。 C.GhFPl蛋白轉錄激活分析。左圖：顯示pGBKT7-GhFPl及陽性對照pGBKT7-53轉入酵母后 能在SD/-Trp-Ade培養(yǎng)基上生長，而陰性對照則不能生長；右圖：pGBKT7-GhFPl及陽性對照 PGBKT7-53轉入酵母后能在顯色實驗中顯藍色，而陰性對照不能顯色。這說明GhFPl蛋白具 有轉錄激活能力。
[0021] 圖2.GhFPl啟動子在棉花纖維發(fā)育階段中的活性分析。GhFPlp:⑶S轉基因棉花 不同發(fā)育階段胚珠及纖維⑶S染色分析。通過棉花遺傳轉化，獲得了GhFPlp:⑶S轉基因棉 花。對不同發(fā)育階段的轉基因棉花胚珠和纖維進行GUS染色，分析在GhFPl啟動子驅動下 ⑶S基因表達活性（如果GhFPl啟動子具有活性，則會激活下游⑶S報告基因表達，在染色 實驗中產(chǎn)生藍色反應）。（A) - (G)分別為開花當天（0天）及開花后1、3、5、10、15和20天 的棉花胚珠和纖維。
[0022] 圖3.GhFPl過量表達轉基因擬南芥葉片表型及表皮毛長度統(tǒng)計分析。
[0023] (A，B，C)野生型擬南芥第九片蓮座葉及表皮毛；(D，E，F(xiàn))GhFPl過量表達轉基因 擬南芥株系LI;(G，H，I)GhFPl過量表達轉基因擬南芥株系L2。（A，D，G)標尺為500ym; (C，F(xiàn)，I)標尺為100ym. (J)野生型和GhFPl過量表達擬南芥生長22天時第九片蓮座葉上 表皮毛長度統(tǒng)計，誤差值代表相對誤差，**代表t-test中有極顯著差異（P〈0. 01)。
[0024] 圖4.GhFPl過量表達轉基因棉花鑒定及纖維長度統(tǒng)計分析。
[0025]A.定量RT-PCR分析轉基因棉花中GhFPl基因的表達。WT為野生型棉花，CK是從 轉基因棉花中分離出來的非轉基因植株，L5-5-1、L5-5-3、L14-1-2及L14-1-5為轉基因棉 花的不同株系；B.Western-blotting檢測棉纖維中GhFPl蛋白的積累。CK是從轉基因棉花 中分離出來的非轉基因植株，L5-5-l、L14-l-2及L14-1-5為轉基因棉花的不同株系；C.轉 基因棉花與野生型棉花纖維的長度比較。WT為野生型棉花，CK1和CK2是從轉基因棉花中 分離出來的非轉基因植株，其余為轉基因棉花的不同株系；D.轉基因棉花與野生型棉花纖 維長度統(tǒng)計?？v坐標表示纖維長度（fiberlength)，橫坐標表示與C圖相同。通過測量成 熟