花生維生素E合成相關(guān)基因AhPK及其在提高植物維生素E含量和耐鹽性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及花生維生素E合成相關(guān)基因及其在提高植物維生素E含量和耐鹽性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素E是一種脂溶性的小分子抗氧化劑，分為生育酚和生育三烯酚兩類，各包括α-、β-、γ-和δ-四種類型，其中以α-生育酚的活性最高，可以被人和動(dòng)物高效吸收和利用。維生素E具有酚氧基結(jié)構(gòu)，在植物光合組織中可使逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基失活，并通過(guò)與膜脂水解產(chǎn)物形成復(fù)合物，清除類囊體膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，阻止膜脂過(guò)氧化的擴(kuò)大，保護(hù)膜的完整性，從而增強(qiáng)植株的抗逆境脅迫能力。在非光合組織中，維生素E能淬滅并能同單線態(tài)氧反應(yīng)，保護(hù)不飽和脂質(zhì)免受單線態(tài)氧損傷；還可以被超氧陰離子自由基氧化，使不飽和油脂免受自由基攻擊，從而抑制油脂的自動(dòng)氧化，延長(zhǎng)油脂的貯存期。另外維生素E還具有調(diào)節(jié)脂肪酸合成、糖類運(yùn)輸、茉莉酸和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)種子萌發(fā)等功能
維生素E主要在高等植物的葉綠體內(nèi)膜上合成，儲(chǔ)存于植物的葉片和種子中，尤其是油料植物的種子。維生素E合成的第一步是前體一尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(I3DP)的合成。其中PDP形成維生素E的疏水尾部，它可由櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸(GGDP)還原而成；也可由GGDP在聚合酶的作用下與葉綠素A聚合成櫳牛兒基櫳牛兒基葉綠素A，后者由櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸還原酶(GGR)催化生成葉綠素A，葉綠素A在葉綠素酶的作用下脫去植醇，生成脫植基葉綠酸A，而植醇在植醇激酶的作用下形成植基一磷酸，之后生成rop。
[0003]植醇激酶是影響維生素E含量的關(guān)鍵酶之一，它可催化植醇向植基一磷酸的生成，進(jìn)而合成生育酚的前體H)P。Valentin等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變體，維生素E含量只有野生型的20%，并通過(guò)圖位克隆法得到了相關(guān)基因VTE5(PK)，該基因編碼植醇激酶。在集胞藻中敲除VTE5的同源基因slrl652后，相應(yīng)突變體中維生素E含量減少了 50%。而且進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，在集胞藻和擬南芥葉、種子中積聚的大多數(shù)和生育酚合成中有關(guān)的PDP來(lái)自于植醇。目前通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化可使油料作物的生育三烯酚含量提高10-15倍，而生育酚含量最多只能提高2-2.5倍。很多學(xué)者認(rèn)為，這種差異主要是由于PDP庫(kù)的供給不足。而植醇激酶和綠色植物中rop的合成有著密切的關(guān)系，因此它可能是維生素E生物合成途徑中的一個(gè)限速酶，它的活性會(huì)直接影響維生素E的總體含量和活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了花生維生素E合成相關(guān)基因其在提高植物維生素E含量和耐鹽性中的應(yīng)用，本發(fā)明將4??基因在花生中過(guò)量，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的維生素E含量、活性和種子的耐鹽性。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn): 花生維生素E合成相關(guān)基因AhPK,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0006]所述基因4??有6個(gè)外顯子，分別對(duì)應(yīng)的堿基分別為第34-366、1316-1378、1498-1631、2011-2128、2270-2384、2685-2863 位。
[0007]克隆所述基因引物名稱與序列如下:
Pl:5 ; - ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3 '；
P2:5 ; - TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 '；
所述引物序列分別與4??基因第1-25堿基、第2857-2881堿基對(duì)應(yīng)。
[0008]本發(fā)明提供了所述的花生維生素E合成相關(guān)基因4^/%編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0009]本發(fā)明還提供了所述的花生維生素E合成相關(guān)基因4^/%在提高植物維生素E含量中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步的，所述基因轉(zhuǎn)入花生中超量表達(dá)，能提高轉(zhuǎn)基因花生植株葉片的維生素E含量，維生素E含量中生育酚總量達(dá)到對(duì)照的2.81倍，活性最高的α生育酚含量達(dá)到對(duì)照2.8倍。
[0011]本發(fā)明還提供了所述的花生維生素E合成相關(guān)基因^^%在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。
[0012]進(jìn)一步的，將花生因在花生中超量表達(dá)，花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率最高可達(dá)到40%。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
1、本發(fā)明從花生中克隆了基因(JA/無(wú)測(cè)序結(jié)果表明該基因有6個(gè)外顯子，分別對(duì)應(yīng)的堿基為 34-366，1316-1378，1498-1631，2011-2128，2270-2384，2685-2863。并對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證。
[0014]2、將基因轉(zhuǎn)入花生中獲得的轉(zhuǎn)基因花生植株形態(tài)發(fā)育正常，其生育酚總量和活性最高的α生育酚含量均明顯增加，所以可以證明本發(fā)明將4??基因在花生過(guò)量表達(dá)可顯著提高葉片維生素E中生育酚和α生育酚含量。
[0015]3、因經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，48h時(shí)可達(dá)到對(duì)照的224倍。
[0016]4、轉(zhuǎn)基因花生種子在0.7% NaCl的發(fā)芽率最高可達(dá)到40%，而非轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率只有15% ;本發(fā)明將4??基因在花生過(guò)量表達(dá)可顯著提高種子的耐鹽性。
[0017]本發(fā)明以花生這一重要的油料作物為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了維生素E合成途徑中的重要基因JA/無(wú)并對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證，這將為以后通過(guò)基因工程調(diào)控花生的維生素E含量、活性和提高植株的抗逆能力奠定基礎(chǔ)。
[0018]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
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【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是本發(fā)明中花生的遺傳轉(zhuǎn)化，a:共培養(yǎng)3 d的子葉外植體；b:培養(yǎng)2 w的子葉外植體；c:添加100 mg /L卡那霉素培養(yǎng)基上篩選的抗性芽(培養(yǎng)4 w); d: 150 mg/L卡那霉素培養(yǎng)基上篩選的抗性苗(培養(yǎng)6 W)。
[0020]圖2是本發(fā)明中擬轉(zhuǎn)必/?基因植株的PCR鑒定。M: Marker DL2000; 1:未轉(zhuǎn)基因植株(對(duì)照)；2-6:擬轉(zhuǎn)基因植株。
[0021]圖3是本發(fā)明中1.5% NaCl脅迫處理后幼苗后4??基因在不同時(shí)間段的相對(duì)表達(dá)量。
[0022]圖4是本發(fā)明中對(duì)照花育23號(hào)和T2代轉(zhuǎn)基因花生種子在0.7%的NaCl溶液中的發(fā)芽情況；a:花育23號(hào)種子；b-c: T2代轉(zhuǎn)基因花生種子。
[0023]圖5是本發(fā)明中用高效液相色譜測(cè)定對(duì)照花育23號(hào)和1~2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的生育酚含量。a:花育23號(hào)葉片的生育酚含量的測(cè)定結(jié)果；b: T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的生育酚含量的測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1:花生維生素E合成相關(guān)基因AhPK 一、實(shí)驗(yàn)材料
1.基因、菌種與花生品種
本發(fā)明克隆了花生/?基因(4??)，大腸桿菌DH5a由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研宄室實(shí)驗(yàn)室保存，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 (購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司)，轉(zhuǎn)基因的受體材料為花生品種“花育23號(hào)”(由山東農(nóng)科院花生所育成，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研宄室實(shí)驗(yàn)室引進(jìn))。
[0026]2.植物培養(yǎng)基花生轉(zhuǎn)化中采用的培養(yǎng)基有:
基本培養(yǎng)基:為MS無(wú)機(jī)鹽+85有機(jī)成分(簡(jiǎn)稱MSB5)，添加3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH=5.8，在121。。、105 Kpa條件下滅菌20min ;
SM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2，4_D ；
SEM芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP。
[0027]cef:頭孢霉素。
[0028]二、實(shí)驗(yàn)方法
本發(fā)明包括以下具體實(shí)驗(yàn)步驟:
1、擴(kuò)增獲得基因
花生維生素E合成相關(guān)基因AhPK,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0029]克隆所述基因引物名稱與序列如下:
Pl:5 ; - ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3 ' (SEQ ID No:4)；
P2:5 ; - TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 ; (SEQ ID No:5);
Pl和P2引物序列分別與4??基因第1-25堿基、第2857-2881堿基對(duì)應(yīng)。
[0030]克隆獲得的所述基因A瞞6個(gè)外顯子，分別對(duì)應(yīng)的堿基分別為第34-366、1316-1378,1498-1631,2011-2128,2270-2384,2685-2863 位。
[0031]所述的花生維生素E合成相關(guān)基因4^/%編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2 所示。
[0032]2、4??基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
(I)擴(kuò)增必/?基因
花生品種“花育23號(hào)”由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研宄室實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了4??基因的編碼區(qū)(其序列表如SEQ ID No:3所示)。
[0033]P3:5 ' - GGTACCATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA ~3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:6);
P4:5 ' - GGTACCTACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:7)；
引物P3和P4是在引物Pl和P2的基礎(chǔ)上加了酶切位點(diǎn)，引物P3和P4對(duì)應(yīng)擴(kuò)增cDNA序列。上述引物序列除去酶切接頭(下劃線部分)外分別與4??基因cDNA序列的第1-25堿基、第969-993堿基對(duì)應(yīng)。
[0034](2)因與克隆載體pUC18及植物表達(dá)載體p