一種基于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ltr的真核表達(dá)線性化載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LTR的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及 應(yīng)用。此發(fā)明不僅可用于研宄REV或其它反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)譯、致病等機(jī)制；而且能實(shí) 現(xiàn)對(duì)外源基因的快速克隆、高效表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV)主要引起以網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生為主要特征的 一組綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生癥、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增 生性疾病。REV感染雞群往往生長遲緩，淘汰率和死亡率升高；并引起感染雞的免疫抑制， 干擾其它禽病疫苗的免疫效應(yīng)，導(dǎo)致免疫失敗。REV前病毒基因組結(jié)構(gòu)具有完整的反轉(zhuǎn)錄 病毒基因組結(jié)構(gòu)，包括5'LTR-gag-pol-env-LTR3'基本結(jié)構(gòu)。其中，LTR為非編碼長末端重 復(fù)序列，與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)譯密切相關(guān)；且被證明具有真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性。5'LTR不但 具有RNA聚合酶II啟動(dòng)子功能，還具有增強(qiáng)子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件。3'LTR除了具有PolyA終 止轉(zhuǎn)錄功能外，也具有啟動(dòng)子特性。因此，有效利用LTR中序列成分，不但可以研宄REV病 毒復(fù)制、轉(zhuǎn)譯、致病等機(jī)制，而且可構(gòu)建表達(dá)載體，用于外源基因表達(dá)及運(yùn)輸。在傳統(tǒng)表達(dá)載 體的構(gòu)建中，往往需要設(shè)計(jì)選擇限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切、連接的方法構(gòu)建載體， 實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。但有時(shí)由于找不到合適的酶切位點(diǎn)，往往導(dǎo)致克隆過程繁瑣，效率低 下。因此，開發(fā)不依賴于限制性內(nèi)切酶的基于REVLTR的線性化真核表達(dá)載體可簡化克隆 過程，實(shí)現(xiàn)基因快速克隆表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 1、要解決的技術(shù)問題
[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供一種基于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LTR的線性真核 表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用方法，用于外源基因的快速克隆與表達(dá)。本發(fā)明的原理和最核心的 關(guān)鍵技術(shù)是科學(xué)地設(shè)計(jì)擴(kuò)增出含REV病毒LTR的線性化載體以及外源基因片段，利用商品 化的重組酶ExnaseTMII不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接在體外快速重組克隆，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增與鑒定；并將陽性克隆轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因高效表達(dá)。
[0005] 所述引物如下：
[0006] a,PCR擴(kuò)增REV病毒LTR線性化載體引物：
[0007]上游引物：5 'ccaacagagatggataccctaggtcaatg3'；
[0008] 下游引物：5 'agacggaagacactggaggcaaaaggctc3' ；
[0009] b，PCR擴(kuò)增外源基因引物：
[0010] 上游引物：5 'cagtgtcttccgtctATGNNNNNNNNNNNNNNN3' ；
[0011] 下游引物：5 'atccatctctgttggCTANNNNNNNNNNNNNNN3' ；
[0012] 本發(fā)明公開了PCR擴(kuò)增REV病毒LTR線性化載體引物以及PCR擴(kuò)增外源基因用于 體外快速重組克隆引物的保守序列。本發(fā)明還公開了一種基于REV病毒LTR的外源基因快 速克隆表達(dá)的方法，其特征在于用重組酶ExnaseTM II，將線性化的REV病毒LTR載體與外 源基因片段PCR產(chǎn)物不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接重組克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。
[0013] 2、技術(shù)方案
[0014] 1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性化載體以及外源基因片段引物：擴(kuò)增含REV病 毒LTR的線性化載體上游引物位于SNV毒株前病毒基因組7783-7811位；擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性化載體下游引物位于SNV毒株前病毒基因組974-1002位；擴(kuò)增外源基因的上游 引物中除了ATG起始密碼子，外源基因特異的15個(gè)堿基N外，均帶有15個(gè)保守的與擴(kuò)增含 REV病毒LTR的線性化載體下游引物互補(bǔ)的堿基；擴(kuò)增外源基因的下游引物中除了終止子， 外源基因特異的15個(gè)堿基N外，均帶有15個(gè)保守的與擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性化載體 上游引物互補(bǔ)的堿基。具體引物序列見附表1，由LifeTechnologies上海賽默飛世爾科技 公司合成。
[0015] 2)基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體的構(gòu)建及應(yīng)用：以含REV病毒前病毒 全基因組質(zhì)粒SNV以及外源基因?yàn)槟０?，利用?中引物，PCR分別擴(kuò)增出含REV病毒LTR的 真核表達(dá)線性化載體REV-LTR以及外源基因片段（附圖1，步驟1);并利用重組酶ExnaseTM II進(jìn)行快速重組克?。ǜ綀D1，步驟2);陽性克隆即可進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表達(dá)鑒定（附圖 1，步驟3)。
[0016] 3、有益效果
[0017] 該發(fā)明設(shè)計(jì)的引物以及構(gòu)建的基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體，不僅對(duì) 研宄反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)譯、致病等分子機(jī)制具有重要意義；而且可實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的快速 克隆高效表達(dá)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明中整合了基于重組酶ExnaseTM II的快速克 隆策略。該克隆方法不依賴于限制性內(nèi)切酶以及連接酶，大大簡化了外源基因的克隆過程， 提高了效率。通過單輪PCR及重組即可成功獲得在REV病毒LTR調(diào)控下的外源基因高效真 核表達(dá)載體。
【附圖說明】
[0018] 圖1基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體的構(gòu)建及應(yīng)用策略
[0019] 步驟1:以含REV病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV以及外源基因?yàn)槟０妫帽?中 引物，PCR分別擴(kuò)增出含REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體REV-LTR以及外源基因片段； 步驟2 :利用重組酶ExnaseTM II進(jìn)行快速重組克??；步驟3 :陽性克隆轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞、表達(dá) 鑒定。
[0020] 圖2電泳分析PCR產(chǎn)物
[0021] 泳道1，擴(kuò)增出的基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體；泳道2,擴(kuò)增出的eGFP 片段。
[0022] 圖3eGFP在基于REV病毒LTR的真核表達(dá)載體中的表達(dá)
[0023] A.轉(zhuǎn)染REV-LTR-eGFP的DF1細(xì)胞，B.未轉(zhuǎn)染正常DF1細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，以下實(shí)施方式結(jié)合附圖給出了基于REV病毒LTR的 真核表達(dá)線性化載體的構(gòu)建及應(yīng)用的示例。
[0025] 實(shí)施例
[0026] 1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性化載體以及EGFP片段引物：擴(kuò)增含REV病毒 LTR的線性化載體上游引物位于SNV毒株前病毒基因組7783-7811位；擴(kuò)增含REV病毒LTR 的線性化載體下游引物位于SNV毒株前病毒基因組974-1002位；擴(kuò)增EGFP片段的上游引 物中除了eGFP片段特異的18個(gè)堿基外，還帶有15個(gè)保守的與擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性 化載體下游引物互補(bǔ)的堿基；擴(kuò)增eGFP片段的下游引物中除了EGFP片段特異的18個(gè)堿基 N外，還帶有15個(gè)保守的與擴(kuò)增含REV病毒LTR的線性化載體上游引物互補(bǔ)的堿基。具體 引物序列見附表1，由LifeTechnologies上海賽默飛世爾科技公司合成。
[0027] 2)基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體以及EGFP片段PCR擴(kuò)增：以含REV 病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV以及pcDNA3. 1-EGFP為模版，表1所述引物為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。如圖1中的步驟1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：40yl水，5yl10倍緩沖液，lyl 10mMdNTP，lyllOymol上游引物，lyllOymol下游引物，lyl10ng/yl的SNV以及 pcDNA3. 1-EGFP，1y1 商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參 數(shù)為：95°C變性3分鐘，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（95°C變性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3 分鐘），最后72°C延伸10分鐘。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。如 圖2所示，其中泳道M表示對(duì)照品DNAMarker的電泳分析圖，其中泳道1、2分別代表基于 REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體REV-LTR(SEQIDNO. 7)以及eGFP片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的電泳分析圖。
[0028] 3)eGFP片段快速克隆進(jìn)基于REV病毒LTR的真核表達(dá)載體：將以上純化的基于 REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體REV-LTR以及eGFP片段PCR產(chǎn)物在商品化重組酶 ExnaseTMII的作用下進(jìn)行重組克隆。如圖1中的步驟2。具體重組反應(yīng)體系如下：純化的 eGFP產(chǎn)物50-100ng，純化的基于REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體50ng，2y1商品化的 ExnaseTMII酶，4yl5倍的緩沖液，其它補(bǔ)加水至20yl。反應(yīng)物于37°C作用30分鐘后， 置冰上5分鐘。隨后將20y1反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到常規(guī)感受態(tài)細(xì)菌，涂LB板。次日挑取細(xì)菌克隆 進(jìn)行質(zhì)粒制備，陽性克隆鑒定。
[0029] 4) eGFP在基于REV病毒LTR的真核表達(dá)載體中的表達(dá)：將獲得的含eGFP的陽性 克?。麨镽EV-LTR-eGFP)轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12hr后，在熒光顯微鏡下觀察eGFP的 表達(dá)。如圖1中的步驟3。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：取2ug的REV-LTR-eGFP質(zhì)粒加入到50ul 的0PTI-MEM培養(yǎng)基，隨后與4ul的Mirus轉(zhuǎn)染試劑混勻；室溫放置45min后，加入450ul的 0PTI-MEM培養(yǎng)基混勻后，直接加到新鮮培養(yǎng)的貼壁的DF1。轉(zhuǎn)染12hr后，在熒光顯微鏡下 觀察EGFP的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，就能在熒光顯微鏡下觀察到大量eGFP的表達(dá)。圖3A 是REV-LTR-eGFP在DF1細(xì)胞中的表達(dá)；圖3B正常DF1細(xì)胞。
[0030] 表1線性化載體和外源基因引物設(shè)計(jì)。
[0031]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體的制備方法，其特 征在于，利用下述引物，以SNV毒株為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得REV病毒LTR線性化載體； 上游弓I物：5 'ccaacagagatggataccctaggtcaatg3'； 下游弓丨物：5 'agacggaagacactggaggcaaaaggctc3'。
2. -種利用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體表達(dá)外源基因的 方法，其特征在于包括以下步驟： 1)以含REV病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV為模板，以SEQ IDNO. 1和2為引物，PCR擴(kuò) 增出含REV病毒LTR的真核表達(dá)線性化載體； 2)以外源基因?yàn)槟０?，以SEQ IDNO. 3和4為引物，PCR擴(kuò)增出外源基因片段； 3)并利用重組酶ExnaseTM II對(duì)步驟1)和2)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速重組克??；陽 性克隆即可進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表達(dá)鑒定。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LTR的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用。該方法是利用序列如SEQ ID NO.1和2的引物，以SNV毒株為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得REV病毒LTR線性化載體。此發(fā)明不僅可用于研究REV或其它反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)譯、致病等機(jī)制；而且能實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的快速克隆、高效表達(dá)。
【IPC分類】C12N15-867, C12N15-66
【公開號(hào)】CN104711294
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510154789
【發(fā)明人】葉建強(qiáng), 田曉彥, 范中雷, 秦愛建, 邵紅霞
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年4月2日