一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方 法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 副豬嗜血桿菌（Haemophliusparasuis，HPS)是一種NAD依賴型、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏 陰性細(xì)小桿菌，屬于巴斯德菌科（Pastteurellacea)嗜血桿菌屬（Haemophilus),有15種血 清型，還有20%的菌株血清型無法確定。該菌能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜 炎，由該菌引起的副豬嗜血桿菌病又稱為豬革拉斯氏?。℅lkser'sdisease)。HPS可以影 響2周齡~4月齡的豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病，常見于5~8周齡，發(fā)病率可 達(dá)40%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%。隨著我國(guó)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的發(fā)展，HPS感染有明顯增加趨勢(shì)， 已成為豬場(chǎng)保育仔豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一，每年給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng) 濟(jì)損失。因此，建立一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于監(jiān)控該菌的繁殖、疾病發(fā)生和流行 以及疾病的及時(shí)防治都具有重要的意義。
[0003] 常規(guī)的生理生化方法雖然可以準(zhǔn)確鑒定待檢菌株，但是操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。中國(guó)專 利CN102220426A公開了副豬嗜血桿菌PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒是針對(duì)傳統(tǒng)的16SrRNA序 列設(shè)計(jì)的引物，對(duì)巴氏桿菌科及嗜血桿菌屬的其他成員（如巴氏桿菌、副禽嗜血桿菌等）特 異性效果欠佳，且其靈敏度仍需改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí) 短、檢測(cè)準(zhǔn)確、有效的副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒。
[0005] 本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供了一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括序列如SEQIDN0: 1-2所示的引物對(duì)F1、R1各100ML、2XPCRMix1.25mL、陽(yáng)性對(duì)照副豬嗜血桿菌DNA200ML 和ddH20 2X1. 25mL; 所述引物對(duì)序列為： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3' 上述檢測(cè)試劑盒內(nèi)為100次含量。
[0006] 進(jìn)一步的，所述PCRMix包括PCR緩沖液，dNTP，PfuDNA聚合酶。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法為使用上述提供的檢 測(cè)試劑盒進(jìn)行副豬嗜血桿菌的檢測(cè)。
[0008] 上述檢測(cè)方法包括以下步驟： a、 提取樣品DNA:提取待檢樣品中的DNA備用； b、 基因擴(kuò)增：將提取的樣品DNA加入檢測(cè)試劑盒中，對(duì)待檢樣品中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； C、結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0009] 進(jìn)一步的，步驟a中，所述待檢樣品為細(xì)菌分離培養(yǎng)物、組織研磨液或血液樣品。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟b中，PCR擴(kuò)增條件為：95°C5min;95°C45s，55°C45s，72°C90s， 32 個(gè)循環(huán)；72°C10min;4°C保存。
[0011] 本發(fā)明中所述的檢測(cè)試劑盒中，陰性對(duì)照為滅菌水（ddH20)，陽(yáng)性對(duì)照為副豬嗜血 桿菌DNA。
[0012] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性好、靈敏度高的引物是實(shí)現(xiàn)所述目的的關(guān)鍵因素，為了克服 傳統(tǒng)的針對(duì)16SrRNA序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)于巴氏桿菌、副禽嗜血桿菌等特異性結(jié)果欠佳的弊 端，本發(fā)明針對(duì)mviN基因序列，設(shè)計(jì)出特異性好、靈敏度高的引物，mviN基因有其自身的獨(dú) 特性，存在于許多對(duì)人、動(dòng)物及植物致病的微生物中，且mviN基因具有高度保守區(qū)域，因此 用于HPS的檢測(cè)時(shí)準(zhǔn)確度高。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為：本發(fā)明針對(duì)具有高度保守區(qū)域的mviN基因序列設(shè) 計(jì)的引物，具有特異性好，能夠準(zhǔn)確的區(qū)別副豬嗜血桿菌LC株同副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺 炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌；且本發(fā)明提供的試劑盒 靈敏度高，可檢測(cè)副豬嗜血桿菌DNA不低于100Xl(T5ng/ML的待檢樣本，耗時(shí)短且檢測(cè)準(zhǔn) 確、有效。
【附圖說明】
[0014] 圖1為檢測(cè)引物的選擇結(jié)果。
[0015] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :固體培養(yǎng)物（引物對(duì)F1/R1) ;2 :液體培養(yǎng)物（引物對(duì) F1/R1) ;3 :固體培養(yǎng)物（引物對(duì)F2/R2) ;4 :液體培養(yǎng)物（引物對(duì)F2/R2) ;5 :陽(yáng)性對(duì)照；6 :陰 性對(duì)照。
[0016] 圖2為副豬嗜血桿菌mviN基因PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果。
[0017] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :副豬嗜血桿菌LC株；2 :副禽嗜血桿菌；3 :豬胸膜肺炎 放線桿菌；4 :巴氏桿菌；5 :化膿隱秘桿菌；6 :金黃色葡萄球菌；7 :豬鏈球菌；8 :陰性對(duì)照。
[0018] 圖3為副豬嗜血桿菌mviN基因PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。
[0019] M：MarkerDL2000 ；1 ： 100XlO^ng/l^L；2 ： 100X10_2ng/m；3 ： 100XlO^ng/M'L；4 ： 100Xl(T4ng/ML;5 :100Xl(T5ng/ML;6 :100Xl(T6ng/ML;7 :100Xl(T7ng/ML;8 :陰性對(duì)照。
[0020] 圖4為死亡豬組織樣品中副豬嗜血桿菌的檢測(cè)結(jié)果。
[0021] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :死亡豬1號(hào)組織樣品；2.死亡豬2號(hào)組織樣品；3 :陰 性對(duì)照；4 :陽(yáng)性對(duì)照。
[0022] 圖5為死亡豬1號(hào)的組織擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合實(shí)施例的具體實(shí)例方式再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但 不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。
[0024] 本發(fā)明所需材料、試劑 1.菌株 副豬嗜血桿菌LC株、副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、 金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存。
[0025] 2?試劑 TSA培養(yǎng)基稱取40gTSA粉末加入940ml蒸餾水中，經(jīng)121°C滅菌15分鐘。冷卻至 50°C左右，加入50ml新生牛血清和10ml過濾除菌的濃度為0. 1%的輔酶（NAD)溶液，充分 搖勻后倒平皿。
[0026] TSB培養(yǎng)基稱取30gTSB粉末加入940ml蒸餾水中，經(jīng)121°C滅菌15分鐘。臨 用前加入50ml新生牛血清和10ml過濾除菌的濃度為0. 1%的NAD溶液，混合均勻后配制而 成。
[0027] PCRMix(PCR 緩沖液 800ML，dNTP 400ML，Pfu DNA 聚合酶 5〇ML)，SDS 溶液，蛋白 酶K，Tris飽和酚，氯仿，異戊醇，無水乙醇。
[0028] 實(shí)施例1 1. DNA模板的制備： 液體培養(yǎng)物取副豬嗜血桿菌LC株菌液10000r/min離心5min，棄上清液，用滅菌水重 懸后，于沸水中煮沸l(wèi)Omin，-20°C凍結(jié)，融化后，10000r/min離心5min，取上清液作為DNA模 板。
[0029] 固體培養(yǎng)物挑取若干個(gè)菌落懸浮于100ML滅菌水中，吹吸混勻后，于沸水中煮沸 lOmin，-20°C凍結(jié)，融化后，10000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。
[0030] 2.引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的故5mviN基因序列（CP001321. 1)，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，送上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PCR引物對(duì)序列見表1。
[0031] 表1PCR引物對(duì)序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括序列如SEQIDNO: 1-2所示的 引物對(duì)FI、R1各100ML、2XPCRMix1. 25mL、陽(yáng)性對(duì)照副豬嗜血桿菌DNA200ML和ddH20 2X1. 25mL； 所述引物對(duì)序列為： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述PCRMix包括PCR緩沖液， dNTP，PfuDNA聚合酶。
3. -種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)方法，其特征在于：使用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒進(jìn) 行副豬嗜血桿菌的檢測(cè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取樣品DNA:提取待檢樣品中的DNA備用； b、 基因擴(kuò)增：將提取的樣品DNA加入檢測(cè)試劑盒中，對(duì)待檢樣品中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； c、 結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟a中，所述待檢樣品為細(xì)菌分離 培養(yǎng)物、組織研磨液或血液樣品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟b中，PCR擴(kuò)增條件為： 95°〇51^11;951：458,551：458,721：9〇8,32個(gè)循環(huán) ；721：1〇111111;41：保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該檢測(cè)試劑盒包括引物對(duì)、PCR Mix、陽(yáng)性對(duì)照和ddH2O。本發(fā)明針對(duì)具有高度保守區(qū)域的mviN基因序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)，特異性好，能夠準(zhǔn)確的區(qū)別副豬嗜血桿菌LC株同副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌；且本發(fā)明提供的試劑盒及檢測(cè)方法靈敏度高，耗時(shí)短且檢測(cè)準(zhǔn)確，對(duì)于監(jiān)控該菌的繁殖、疾病發(fā)生和流行以及疾病的及時(shí)防治都具有重要的意義。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公開號(hào)】CN104711359
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510120697
【發(fā)明人】于江, 王金寶, 吳家強(qiáng), 張玉玉, 杜以軍, 李俊, 陳智
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月19日