高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒 (HP-PRRSV)的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV)是單鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15kb，屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng) 脈炎病毒屬。豬藍(lán)耳病又稱"豬繁殖與呼吸綜合癥"，該病毒可引起成年豬繁殖障礙、流產(chǎn) 和死胎，以及仔豬呼吸異常，是一種高度傳染性疾病。1987年豬藍(lán)耳病首次在北美發(fā)現(xiàn)，現(xiàn) 已席卷全球，成為危害性最大的豬傳染性疾病之一。豬藍(lán)耳病病毒可以分為兩種基因型， 即以VR-2332株為代表的美洲型毒株和以Lelystadvirus(LV)代表的歐洲型毒株。高致 病性豬藍(lán)耳病是由高致病性豬藍(lán)耳病病毒（HighlyPathogenicPorcineReproductive andRespiratorySyndromeVirus,HP-PRRSV)引起的一種急性高致死性傳染病，于2006年 在中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)的當(dāng)年在中國(guó)感染了 200萬(wàn)頭豬，死亡率達(dá)到20%。序列分析表明， HP-PRRSV在非結(jié)構(gòu)蛋白2 (NSP2)編碼區(qū)內(nèi)存在一段不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的缺失。
[0003]目前，檢測(cè)豬藍(lán)耳病病毒的方法包括病毒的分離和培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA) 等，但這些方法在靈敏性和特異性方面仍存在一定不足。反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)由于靈 敏性和特異性較高，已經(jīng)成為豬藍(lán)耳病檢測(cè)的常用方法。但常規(guī)RT-PCR需要進(jìn)行后續(xù)電 泳鑒定，易發(fā)生交叉污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性，且操作耗時(shí)較長(zhǎng)。相比之下，熒光定量PCR技術(shù) (real-timeRT-PCR)具有更高的靈敏性，且無(wú)需PCR后續(xù)處理，能有效避免交叉污染并提高 檢測(cè)效率。
[0004] 然而，目前基于RT-PCR檢測(cè)藍(lán)耳病的方法都要進(jìn)行病毒RNA提取，然后以RNA為 模板進(jìn)行檢測(cè)；這一RNA提取步驟無(wú)疑大大增加了檢測(cè)工作量、時(shí)間和成本，難以實(shí)現(xiàn)高通 量檢測(cè)；此外，提取RNA的過(guò)程仍容易發(fā)生RNA降解或交叉污染等事件；且對(duì)于痕量樣本， 提取RNA仍存在較大困難。
[0005] 因此，現(xiàn)有的基于RT-PCR檢測(cè)藍(lán)耳病的方法還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的高致病性豬藍(lán)耳 病病毒的檢測(cè)方法，以及該檢測(cè)方法所使用的引物和探針。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0008] 一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)引物，所述檢測(cè)引物如SEQIDNo:1和SEQID No:2所示。
[0009] 一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針如SEQIDNo:3所示。 [0010] 一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)方法，使用上述檢測(cè)引物和檢測(cè)探針進(jìn)行檢 測(cè)，包括以下步驟：
[0011] 將血清樣本直接加至熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行熒光定量RT-PCR，反應(yīng)結(jié) 束后檢測(cè)PCR產(chǎn)物中是否含有高致病性豬藍(lán)耳病病毒；其中，
[0012] 所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)引物，其特征在于，所述檢測(cè)引物如SEQ ID No: I 和SEQ ID No:2所示。
2. -種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)探針，其特征在于，所述檢測(cè)探針如SEQ ID No:3 所示。
3. -種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的檢測(cè) 引物和權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針，包括以下步驟： 將血清樣本直接加至熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行熒光定量RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后 檢測(cè)PCR產(chǎn)物中是否含有高致病性豬藍(lán)耳病病毒；其中， 所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為：
所述熒光定量RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5土TC反應(yīng)30min，95 °C反應(yīng)5min; 94°C變性30s，60±1°C退火/延伸40s，反應(yīng)35~45個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光 定量RT-PCR反應(yīng)體系為：
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光 定量RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C反應(yīng)30min，95°C反應(yīng)5min;94°C變性30s，60°C退火/延 伸40s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)方法，是將血清樣本直接加至包括檢測(cè)引物和探針的熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行RT-PCR，結(jié)束后檢測(cè)是否含有高致病性豬藍(lán)耳病病毒。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR管中連續(xù)、自動(dòng)進(jìn)行病毒RNA的釋放、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)；從得到病毒血清樣本到獲得檢測(cè)結(jié)果只需要1.5個(gè)小時(shí)；靈敏性、準(zhǔn)確性可與傳統(tǒng)RT-PCR相媲美；克服了傳統(tǒng)RT-PCR需要提取RNA這一繁瑣步驟的不足，減少操作步驟，提高檢測(cè)速度，節(jié)省成本，有效避免交叉污染，能進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳病病毒的高通量檢測(cè)，對(duì)快速發(fā)現(xiàn)高致病性豬藍(lán)耳病疫情，及時(shí)制定防控措施具有重要的意義。
【IPC分類】C12Q1-70, C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-93
【公開號(hào)】CN104711369
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310684967
【發(fā)明人】茍德明, 張利, 康康
【申請(qǐng)人】茍德明, 張利, 康康
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2013年12月13日