經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞的建立方法
【專利說(shuō)明】經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞的建立方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)的制造，更具體而言涉及建立如可有 效制造目的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的技術(shù)。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 使用基因重組技術(shù)生產(chǎn)作為醫(yī)藥有用的蛋白質(zhì)時(shí)，使用動(dòng)物細(xì)胞，則由于原核細(xì) 胞實(shí)現(xiàn)不了的復(fù)雜的翻譯后修飾或折疊變得可能，從而動(dòng)物細(xì)胞作為用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn) 的宿主細(xì)胞而多用。
[0003] 近年、抗體或生理活性蛋白質(zhì)等的多種生物藥品輩出，但在動(dòng)物細(xì)胞中有效生產(chǎn) 重組蛋白質(zhì)的技術(shù)與生物藥品的低成本化連系，約束向患者的穩(wěn)定的供給。
[0004] 從而，期望生產(chǎn)效率更高的蛋白質(zhì)的制造方法。
[0005] 知通過(guò)向宿主細(xì)胞，除目的蛋白質(zhì)的基因之外，導(dǎo)入其他結(jié)構(gòu)基因而使以高的表 達(dá)量表達(dá)，從而使目的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率升高的技術(shù)。
[0006] 例如，公開(kāi)有包括培養(yǎng)高表達(dá)作為膜輸送蛋白質(zhì)的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)子（TauT)基 因、并且導(dǎo)入編碼希望得到的蛋白質(zhì)的DNA的細(xì)胞的蛋白質(zhì)的制造方法（專利文獻(xiàn)1 : W02007/119774、專利文獻(xiàn) 2 :W02009/051109)。
[0007] 另外公開(kāi)有，通過(guò)使用導(dǎo)入作為?；撬岷铣赏緩降拿傅陌腚装彼醽喕撬崦擊让?(CSAD)基因的細(xì)胞來(lái)增加希望得到的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量（專利文獻(xiàn)3 :W02008/114673)。
[0008] 另外公開(kāi)有，通過(guò)使用導(dǎo)入丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)基因的細(xì)胞而使希望得到的 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量增加（專利文獻(xiàn)4 :W02009/020144)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是使從丙氨酸生 成谷氨酸的酶，也被知為人肝細(xì)胞中含的酶GTP (谷氨酰胺-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶）。
[0009] 另外公開(kāi)有，通過(guò)使用導(dǎo)入有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)子功能的陰離子交換劑（AE)的基因 的細(xì)胞而使希望得到的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量增加（專利文獻(xiàn)5 :W02009/054433)。
[0010] 再公開(kāi)有，CSAD和TauT的共表達(dá)、ALT和TauT的共表達(dá)、碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)子和CSAD、 或者碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)子和ALT的共表達(dá)結(jié)果，更加增加希望得到的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量（專利文 獻(xiàn) 3-5)〇
[0011] 但是，本發(fā)明人，從至今的研宄發(fā)現(xiàn)，向宿主細(xì)胞導(dǎo)入2種外來(lái)基因時(shí)，即使是名 自單獨(dú)導(dǎo)入則可建立該基因穩(wěn)定地表達(dá)的細(xì)胞株的情況，也有無(wú)法建立使所述2種外來(lái)基 因一同穩(wěn)定地高表達(dá)的細(xì)胞株的情況。此時(shí)，與至少一方的所述外來(lái)基因相同的基因或?qū)?應(yīng)基因的在宿主細(xì)胞的表達(dá)量用qPCR在檢測(cè)限界以下時(shí)，導(dǎo)致無(wú)法建立使2種基因一同穩(wěn) 定地高表達(dá)的細(xì)胞株。特別是，有相同的功能的蛋白質(zhì)的基因或與相同的代謝系統(tǒng)反應(yīng)相 關(guān)的酶的基因、例如，使2種膜輸送蛋白質(zhì)一同高表達(dá)的宿主細(xì)胞或使2種酶一同高表達(dá)的 宿主細(xì)胞的建立是不可能的。另外，GlycArt公司的2種糖鏈關(guān)聯(lián)酶基因在宿主細(xì)胞中表 達(dá)，但再使高表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)源的抗體產(chǎn)生細(xì)胞由于酶基因表達(dá)不穩(wěn)定，見(jiàn)到抗體的無(wú) 巖藻糖基含量脫離期待的范圍的事例。
[0012] 如此，使不同的2種以上的基因高表達(dá)伴隨多個(gè)困難。
[0013] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】
[0014] 【專利文獻(xiàn)】
[0015] 專利文獻(xiàn) I :TO2007/119774
[0016] 專利文獻(xiàn) 2 :W02009/051109
[0017] 專利文獻(xiàn) 3 :W02008/114673
[0018] 專利文獻(xiàn) 4 :W〇2〇〇9/〇2〇144
[0019] 專利文獻(xiàn) 5 :W02009/054433 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0020] 【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0021] 本發(fā)明提供在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)中使用的宿主細(xì)胞中，用于使表達(dá)困難的基因穩(wěn)定 地高表達(dá)的新穎的技術(shù)。另外，也提供建立倍增時(shí)間短、穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株的技術(shù)。
[0022] 【解決課題的技術(shù)方案】
[0023] 本發(fā)明人的研宄組以前發(fā)現(xiàn)了，作為不編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，通過(guò)在宿主細(xì) 胞內(nèi)作為RNA表達(dá)，控制NfkBia(核因子κ B抑制劑α、或者Ι-κ B(抑制劑-K B)) 的表達(dá)，有使重組抗體等的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生能力升高的功能的特定的核酸序列（PCT/ JP2012/058577 (W02012/137683))。本發(fā)明人將有那樣的功能的RNA或DNA或它們的序列 總稱而命名為APES (抗體產(chǎn)生增強(qiáng)序列）（根據(jù)情況，也稱為PPES (多肽產(chǎn)生增強(qiáng)序列））。
[0024] APES被認(rèn)為是，經(jīng)NfkBia (或者I- κ B)的表達(dá)抑制而活化NF- κ ( κ ) B的功能性 核酸。另外，作為有這樣的功能的核酸，也知KSHV miRNA-Kl等（Lei，Xiufen et al.，Nat. Cell. Biol.，12(2)，pl93-199, 2010)。
[0025] 這次，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 APES的新的用途。
[0026] 即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，APES使（1)在通常的細(xì)胞中使表達(dá)困難的特定的基因高表達(dá) 的細(xì)胞的構(gòu)建，或（2)在通常的細(xì)胞中建立困難的使不同的2種以上的基因穩(wěn)定地高表達(dá) 的細(xì)胞的構(gòu)建成為可能，具有使導(dǎo)入基因穩(wěn)定地高表達(dá)的功能。
[0027] 從而，本申請(qǐng)?zhí)峁┩ㄟ^(guò)將APES基因?qū)胨拗骷?xì)胞，使表達(dá)困難的外來(lái)基因或表達(dá) 不穩(wěn)定的外來(lái)基因在所述細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地高表達(dá)的方法。
[0028] 另外，本申請(qǐng)?zhí)峁?，通過(guò)向宿主細(xì)胞導(dǎo)入APES基因，建立倍增時(shí)間快，穩(wěn)定增殖的 細(xì)胞的方法。
[0029] APES基因是編碼抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA(不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA)的 DNA0
[0030] 本申請(qǐng)發(fā)明的要點(diǎn)如下。
[0031] (1)建立可使2個(gè)以上的外來(lái)基因穩(wěn)定地表達(dá)的用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞株的 方法，其包括：向細(xì)胞導(dǎo)入抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因，使該基因表達(dá)。
[0032] (2)⑴的方法，其中2個(gè)以上的外來(lái)基因編碼同時(shí)穩(wěn)定地表達(dá)困難的蛋白質(zhì)。
[0033] (3) (2)的方法，其特征在于，同時(shí)穩(wěn)定地表達(dá)困難的蛋白質(zhì)均屬于有類似的功能 的蛋白質(zhì)。
[0034] (4) (3)的方法，其中有類似的功能的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)運(yùn)子或代謝酶。
[0035] (5) (1)~（4)的方法，其中向細(xì)胞導(dǎo)入2種以上的轉(zhuǎn)運(yùn)子（TauT和AE1)的基因。
[0036] (6)⑴~（4)的方法，其中向細(xì)胞導(dǎo)入2種以上的代謝酶（丙酮酸代謝途徑的酶、 ALTl和PC)的基因。
[0037] (7) (1)~（4)的方法，其中向細(xì)胞導(dǎo)入TauT及2種代謝酶的基因。
[0038] (8)構(gòu)建倍增時(shí)間快的細(xì)胞的方法，其包括：向細(xì)胞導(dǎo)入含抑制NfkBia的表達(dá)的 非編碼RNA的基因的DNA構(gòu)建物，使該非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0039] (9)細(xì)胞，其中向細(xì)胞導(dǎo)入抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因，使該基因表 達(dá)，并且，使2個(gè)以上的外來(lái)基因穩(wěn)定地表達(dá)。
[0040] (10) (1)~⑶的方法或者（9)的細(xì)胞，其中抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA是 含可由堿基對(duì)形成結(jié)合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25堿基長(zhǎng)的連續(xù)的序列的至30 個(gè)堿基長(zhǎng)的低分子RNA。
[0041] (11) (1)~⑶的方法、或者（9)的細(xì)胞，其中抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA 是含可由堿基對(duì)形成結(jié)合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25堿基長(zhǎng)的連續(xù)的序列的至 561堿基長(zhǎng)的mRNA型非編碼RNA。
[0042] (12) (1)~⑶的方法、或者（9)的細(xì)胞，其中抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA 是含可由堿基對(duì)形成結(jié)合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25堿基長(zhǎng)的連續(xù)的序列的 561~1579堿基長(zhǎng)的mRNA型非編碼RNA。
[0043] (13) (10)~（12)的方法或細(xì)胞，其中19~25個(gè)堿基長(zhǎng)的連續(xù)的序列是SEQ ID NO:2所示的堿基序列中的任意的部分序列或其互補(bǔ)序列。
[0044] (14) (1)~⑶的方法、或者（9)的細(xì)胞，其中抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的 基因是有SEQ ID NO: 1~16及29之任一個(gè)的堿基序列。
[0045] (15) (1)~⑶的方法、或者（9)的細(xì)胞，其中抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的 基因是有以下的喊基序列或其互補(bǔ)序列的DNA :
[0046] (a)可由堿基對(duì)形成結(jié)合于SEQ ID NO: 1~16及29之任一個(gè)的堿基序列的序列；
[0047] (b)與SEQ ID NO: 1~16及29之任一個(gè)的堿基序列除1或數(shù)堿基外相同的堿基 序列；
[0048] (c)含SEQ ID NO: 1~16及29之任一個(gè)的堿基序列的，NfkBia基因的3'側(cè)非翻 譯區(qū)域的部分序列；
[0049] (d)與上述（c)的序列除1或數(shù)堿基外相同的堿基序列。
[0050] (16) (1)~⑶的方法或（9)的細(xì)胞，其中向細(xì)胞再導(dǎo)入有希望得到的蛋白質(zhì)的基 因。
[0051] (17) (16)的方法或細(xì)胞，其中希望得到的蛋白質(zhì)是抗體。
[0052] (18)上述（1)所述的建立可使2個(gè)以上的外來(lái)基因穩(wěn)定地表達(dá)的用于重組蛋白質(zhì) 生產(chǎn)的細(xì)胞株的方法，其包括：
[0053] 向細(xì)胞導(dǎo)入第1外來(lái)基因及抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因，使這些基因 表達(dá)，及
[0054] 向細(xì)胞導(dǎo)入與第1外來(lái)基因同時(shí)穩(wěn)定地表達(dá)困難的第2外來(lái)基因，
[0055] 其中
[0056] 第1和第2外來(lái)基因是編碼蛋白質(zhì)的基因，
[0057] 建立表達(dá)抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因、及編碼蛋白質(zhì)的第1和第2外 來(lái)基因的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)用的細(xì)胞株。
[0058] (19)上述（1)所述的可建立使2個(gè)以上的外來(lái)基因穩(wěn)定地表達(dá)的用于重組蛋白質(zhì) 生產(chǎn)的細(xì)胞株的方法，其包括：
[0059] 向細(xì)胞導(dǎo)入第1外來(lái)基因及抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因，使這些基因 表達(dá)，
[0060] 向細(xì)胞導(dǎo)入第2外來(lái)基因，及
[0061] 向細(xì)胞導(dǎo)入與第2外來(lái)基因同時(shí)穩(wěn)定地表達(dá)困難的第3外來(lái)基因，
[0062] 其中
[0063] 第1、第2、及第3外來(lái)基因是編碼蛋白質(zhì)的基因，
[0064] 建立表達(dá)抑制NfkBia的表達(dá)的非編碼RNA的基因、及編碼蛋白質(zhì)的第1、第2、第 3外來(lái)基因的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)用的細(xì)胞株。
[0065] (20) (18)或（19)所述的方法，其中第1外來(lái)基因是TAUT (牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)子）基因。
[0066] (21) (18)~（20)之任一項(xiàng)所述的方法，其中向細(xì)胞再導(dǎo)入希望得到的蛋白質(zhì)的 基因，建立所述希望得到的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)用的宿主細(xì)胞株。
[0067] 【發(fā)明效果】
[0068] 由本發(fā)明可在宿主細(xì)胞中使各種的外來(lái)基因穩(wěn)定地高表達(dá)。從而，利用本發(fā)明，可 將在通常的細(xì)胞中表達(dá)困難的多肽制造成藥品。另外，提高表達(dá)困難的抗原蛋白質(zhì)的表達(dá) 量，對(duì)那樣的抗原的抗體的開(kāi)發(fā)變得容易。另外，由本發(fā)明可構(gòu)建使多個(gè)基因穩(wěn)定地高表達(dá) 的細(xì)胞，從而重組多個(gè)有用基因的，用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的制作變得可能。
[0069] 另外，由本發(fā)明的別的實(shí)施方式，可建立倍增時(shí)間快、穩(wěn)定增殖的細(xì)胞。從而，在使 用培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，將那樣的細(xì)胞作為宿主利用，則可有效生產(chǎn)目的 蛋白質(zhì)。 【【附圖說(shuō)明】】
[0070] 【圖1】圖1示鑒定的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的在序列及小鼠基因組的位置。（參考例 D
[0071] 【圖2】圖2示在CH0-DG44細(xì)胞中使Mabl (抗IL-6受體抗體）高表達(dá)的產(chǎn)生抗體 的細(xì)胞的繼代培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度。（參考例2)
[0072] 【圖3】圖3示在CHO-DXBlls細(xì)胞中使Mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體）高 表達(dá)的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的繼代培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度。（參考例2)
[0073] 【圖4】圖4示在Mab2 (抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體）產(chǎn)生細(xì)胞的IL罐流加培 養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度。（參考例2)
[0074] 【圖5】圖5示在產(chǎn)生Mab2的細(xì)胞的IL罐的流加培養(yǎng)后期第13天的AI462015轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度之上調(diào)。（參考例2)
[0075] 【圖6】圖6示在Mabl (抗IL-6受體抗體）產(chǎn)生潛力低的細(xì)胞的IL罐流加培養(yǎng)第 3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度。（參考例2)
[0076] 【圖7】圖7是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列434bp的表達(dá)質(zhì)粒。（參考 例3)
[0077] 【圖8】圖8是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列165bp的表達(dá)質(zhì)粒。（參考 例3)
[0078] 【圖9】圖9是作為對(duì)照僅使潮霉素抗性基因表達(dá)的質(zhì)粒。（參考例3)
[0079] 【圖10】圖10示由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)的一部分序列的強(qiáng)表達(dá)而增加 Mabl 產(chǎn)生量。（參考例3)
[0080] 【圖11】圖11示在抗體高產(chǎn)生細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015的強(qiáng)表達(dá)和NfkBia表達(dá) 抑制。（參考例4)
[0081] 【圖12】圖12示NfkBia表達(dá)定量中使用的探針組。（參考例4)
[0082] 【圖13】圖13示在抗體高產(chǎn)生細(xì)胞的NfkBia表達(dá)抑制的定量結(jié)果。（參考例4)
[0083] 【圖14】圖14示小鼠 MCMV IE2啟動(dòng)子上（SEQ ID NO:23)的8個(gè)的NfkB結(jié)合部 位（加下劃線部）。（參考例4)
[0084]【圖15】圖15是表達(dá)microRNA的解析法的概略。（參考例5)
[0085] 【圖16】圖16示在抗體高產(chǎn)生細(xì)胞中高表達(dá)的microRNA來(lái)源的PCR產(chǎn)物。（參考 例5)
[0086] 【圖17】圖17是在表達(dá)pHyg-TAUT的細(xì)胞中使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI642048 (437p)的一部