zae)、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、無丙二酸梓 檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus)、黃色粘球菌（Myxococcus xanthus)、具核梭桿菌 (Fusobacterium nuleatum)、黃青霉（Penicillium chrysogenum)、海洋 γ 蛋白菌和產(chǎn)丁 酸細(xì)菌。例如，具有PHB-c〇-4HB生物合成的微生物宿主（例如，生物體）在本文參照大腸 桿菌宿主來例示。然而，基于現(xiàn)在可獲得的超過550種物種的全基因組序列（其中超過一 半可以在例如NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)上獲得），其中包括395種微生物基因組和多種酵母、真 菌、植物和哺乳動(dòng)物基因組，在親緣關(guān)系相近或遙遠(yuǎn)的物種的一個(gè)或多個(gè)基因中鑒定出編 碼所需的PHB- C〇-4HB生物合成活性的基因（包括例如對(duì)已知基因的同源基因、直系同源基 因、旁系同源基因和非直系同源基因置換，以及生物體之間的遺傳變異的易位）是常規(guī)的 并且在本領(lǐng)域是為人熟知的。因此，使得能夠在特定生物體（例如大腸桿菌）中生物合成 PHB-c〇-4HB和本文所公開的其他化合物的代謝改變能夠容易地應(yīng)用于其他生物體，同樣包 括原核生物體和真核生物體。鑒于本文給出的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知曉在一 種生物體中例示的代謝改變可以等同地應(yīng)用于其他生物體。
[0056] 制備產(chǎn)生4ΗΒ的轉(zhuǎn)基因宿主
[0057] 使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行遺傳改造以獲得產(chǎn)生PHB-C0-4HB的轉(zhuǎn)基因（重 組）宿主。針對(duì)產(chǎn)生PHB-C0-4HB的宿主株而克隆和/或評(píng)估的基因示于下表1A中，還顯示 了適當(dāng)?shù)拿笇W(xué)委員會(huì)編號(hào)（EC編號(hào)）及參考文獻(xiàn)。一些基因是為了優(yōu)化密碼子而合成的， 而另一些是從天然或野生型宿主的基因組DNA中通過PCR克隆出的。本文所用的"異源"是 指來自另一宿主。宿主可以是相同或不同的物種。圖1是產(chǎn)生PHB-C0-4HB的示例性途徑。 [0058] 表1A.根據(jù)圖1的在產(chǎn)生PHB-CO-4HB的微生物宿主株中過多產(chǎn)生或缺失的基因。 基因名稱后的星號(hào)（*)表示該核苷酸序列已針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)化過。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聚羥基烷酸酯共聚物組合物，所述組合物包含多種聚羥基烷酸酯共聚物分子， 其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子（i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體、 (ii)具有的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%、且（iii)具有的生物 源含量多80%。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子 量為 250kDa~2.OMDa。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 為-60。。~-5。。。
4. 如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中4-羥基 丁酸酯單體的單體摩爾百分比不隨所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中： 所述聚羥基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量總計(jì)多80%的一種或多種含碳原料 在發(fā)酵過程中制得的； 所述一種或多種含碳原料包含選自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麥 芽糖、阿拉伯糖及其混合物組成的組的碳源；并且 收率大于〇.25g聚羥基烷酸酯共聚物分子每克碳源。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為25%~70%。
7. 如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中的 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為30%~40%。
8. 如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為40%~50%。
9. 如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為50%~60%。
10. 如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為60%~70%。
11. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的生 物源含量多95%。
12. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的生 物源含量多99%。
13. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的生 物源含量為100%。
14. 一種聚合物共混物組合物，所述聚合物共混物組合物包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng) 所述的聚羥基烷酸酯組合物和多種第二聚合物分子。
15.如權(quán)利要求14所述的聚合物共混物組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子 占所述聚合物共混物組合物的5重量％~95重量％。
16.如權(quán)利要求14或15所述的聚合物共混物組合物，其中，所述聚合物共混物組合物 是連續(xù)相的或雙連續(xù)相的。
17. 如權(quán)利要求14、15或16所述的聚合物共混物組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚 物分子和所述第二聚合物分子形成單一相。
18. 如權(quán)利要求14~17中任一項(xiàng)所述的聚合物共混物組合物，其中，所述聚合物共混 物組合物的結(jié)晶度低于缺乏所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的相應(yīng)組合物。
19. 一種生物質(zhì)組合物，所述生物質(zhì)組合物包含權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的組合 物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子占所述生物質(zhì)組合物的50重量％以上。
20. -種制備聚羥基烷酸酯共聚物組合物的方法，所述組合物包含多種聚羥基烷酸酯 共聚物分子，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子（i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁 酸酯單體、（ii)具有的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%、且（iii)具 有的生物源含量多80% ;所述方法包括： 在一種或多種含碳原料的存在下培養(yǎng)生物體，所述培養(yǎng)在（a)所述一種或多種含碳原 料轉(zhuǎn)化為3-羥基丁?；鵆oA和4-羥基丁?；鵆oA，并且（b)所述3-羥基丁?；鵆oA和 4-羥基丁?；鵆oA聚合形成所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的條件下進(jìn)行，從而形成所述組 合物；其中： 所述生物體已被遺傳改造成包含聚羥基烷酸酯合酶、乙酰基CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰 乙?；鵆oA還原酶、琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酸半醛還原酶和CoA轉(zhuǎn)移酶的酶活性，并且不 包含NAD+依賴型琥珀酸半醛脫氫酶和/或NADP+依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的酶活性，并且 所述一種或多種含碳原料總共的生物源含量多80%。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述生物體被進(jìn)一步遺傳改造成： (a) 包含（i)a_酮戊二酸脫羧酶或2-氧代戊二酸脫羧酶以及（ii)L-l，2-丙二醇氧化 還原酶的酶活性，并且 (b) 不包含⑴硫酯酶II、（ii)多功能?；鵆oA硫酯酶I和蛋白酶I和溶血磷脂酶L、 (iii)?；鵆oA硫酯酶和（iv)醛脫氫酶中的一種或多種的酶活性。
22. 如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料包含選自由葡萄 糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖及其混合物組成的組的碳源。
23. 如權(quán)利要求20、21或22所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料包含糖蜜、淀 粉、脂肪酸、植物油、木質(zhì)纖維素材料、乙醇、乙酸、甘油、源自生物質(zhì)的合成氣和源自填埋氣 的甲烷中的一種或多種。
24. 如權(quán)利要求20~23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料不包含 y- 丁內(nèi)酯、1，4- 丁二醇、4-羥基丁酸、3-羥基丁酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸、蘋果酸、延胡 索酸、檸檬酸、琥珀酸或3-羥基丁酸。
25. 如權(quán)利要求20~24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料總共的 生物源含量多95%。
26. 如權(quán)利要求20~25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料總共的 生物源含量多99%。
27. 如權(quán)利要求20~26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述一種或多種含碳原料總共的 生物源含量為100%。
28. 如權(quán)利要求20~27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為25%~70%。
29. 如權(quán)利要求20~28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為30%~40%。
30. 如權(quán)利要求20~28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為40 %~50%。
31. 如權(quán)利要求20~28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為50%~60%。
32. 如權(quán)利要求20~28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為60 %~70%。
33. 如權(quán)利要求20~32中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從生物體中分離聚羥基 烷酸酯共聚物分子，以使得聚羥基烷酸酯共聚物組合物基本不含所述生物體。
34. -種根據(jù)權(quán)利要求20~33中任一項(xiàng)所述的方法制備的聚羥基烷酸酯共聚物組合 物。
35. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的重量平均分 子量為 250kDa~2.OMDa。
36. 如權(quán)利要求34或35所述的組合物，其中，所述組合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 為-60。。~-5。。。
37. 如權(quán)利要求34、35或36所述的組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯共聚物分子中 4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比不隨著所述聚羥基烷酸酯共聚物分子的分子量的增 加而下降。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種聚羥基烷酸酯共聚物組合物。該組合物包含多種聚羥基烷酸酯共聚物分子。所述聚羥基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體、(ii)具有的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％。本發(fā)明還提供了一種制備聚羥基烷酸酯共聚物組合物的方法。所述方法包括在下述條件下在一種或多種含碳原料的存在下培養(yǎng)生物體，從而形成所述組合物；在所述條件下，(a)所述一種或多種含碳原料轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰基CoA和4-羥基丁?；鵆oA，并且(b)所述3-羥基丁?；鵆oA和4-羥基丁?；鵆oA聚合形成聚羥基烷酸酯共聚物分子。所述生物體已被遺傳改造成包含一些特定的酶活性，且不包含另一些特定的酶活性。所述一種或多種含碳原料總共的生物源含量≥80％。
【IPC分類】C12P7-62, C08L67-04
【公開號(hào)】CN104718297
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380052531
【發(fā)明人】T·M·拉姆塞耶爾, J·A·貝克邁爾, W·R·法梅爾, C·摩爾斯, H·辛那鵬, O·P·皮普爾斯, Y·沙布塔
【申請(qǐng)人】麥特波力克斯公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2013年10月1日
【公告號(hào)】EP2906707A1, US20150240273, WO2014058655A1, WO2014058655A8