一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌np23菌粉保護(hù)劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物法防治水華和赤潮技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌 NP23菌粉保護(hù)劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，未被處理的工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水的 排放逐年增加，導(dǎo)致受納水體的富營(yíng)養(yǎng)化呈加重趨勢(shì)。在2008年國(guó)家環(huán)保局監(jiān)測(cè)的26個(gè) 湖（庫(kù)）中有14個(gè)呈現(xiàn)不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化，占53. 8%，而城市內(nèi)湖的富營(yíng)養(yǎng)化達(dá)到了 100%。造成的直接后果是水質(zhì)惡化、水味腥臭難聞、藻類過量繁殖、生物多樣性下降、水華 頻繁發(fā)生，不僅喪失了景觀功能，甚至危害到居民健康。因此尋求有效的水華防治途徑勢(shì)在 必行。而常規(guī)的治理方法例如化學(xué)法和物理法在應(yīng)對(duì)有害藻華時(shí)效果不甚理想，在此情況 下，利用溶藻菌控藻成為防治水華和赤潮的可能手段，引起了眾多科研人員的關(guān)注。國(guó)外對(duì) 溶藻細(xì)菌的研宄已經(jīng)有幾十年的歷史，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研宄雖起步較晚，但也取得了一定的研 宄進(jìn)展。目前主要集中在溶藻菌種類和溶藻效果的研宄、溶藻機(jī)理和溶藻物質(zhì)的研宄等，但 對(duì)如何優(yōu)化溶藻菌菌粉保護(hù)劑配方的研宄不多。
[0003] 本研宄用Plackett-Burman(PB)法篩選出影響溶藻菌NP23(從河南省平頂山市白 龜山水庫(kù)大壩下游水體中分離、篩選到一株具高效溶藻能力的細(xì)菌）真空冷凍干燥存活率 3個(gè)重要保護(hù)劑（蔗糖、明膠和甘油），然后對(duì)篩選出的重要因素在最佳值區(qū)域里用響應(yīng)面 方法（response surface methodology，RSM)擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，從而得到 準(zhǔn)確有效的一個(gè)穩(wěn)定的工藝條件。優(yōu)化后最大限度地發(fā)揮保護(hù)劑的保護(hù)功能，減少菌體在 冷凍干燥過程中的死亡，提高細(xì)胞的存活率。開發(fā)高效凍干保護(hù)劑，為溶藻細(xì)菌的保存，運(yùn) 輸和使用提供便利，對(duì)治理日益嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化溶藻菌NP23菌粉保護(hù)劑配方工藝，克服了現(xiàn)有技 術(shù)中沒有相關(guān)優(yōu)化溶藻菌NP23菌粉保護(hù)劑配方工藝的不足。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，通過以下步驟完成：
[0007] 1)測(cè)溶藻菌NP23在發(fā)酵罐的生長(zhǎng)曲線及濃度；
[0008] 2)采用Plackett-Burman法篩選出影響溶藻菌真空冷凍干燥存活率的重要因素；
[0009] 3)篩選出的重要因素在最佳值區(qū)域里用響應(yīng)面方法（response surface methodology，RSM)擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，確定最佳配比條件；
[0010] 4)檢測(cè)優(yōu)化后溶藻菌NP23真空冷凍干燥保護(hù)劑菌粉的溶藻效果。
[0011] 進(jìn)一步，
[0012] 步驟（1)中具體通過分光光度計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)菌液OD值繪制發(fā)酵液中溶藻 菌生長(zhǎng)曲線，確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，所采用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
[0013] 步驟（2)中影響溶藻菌真空冷凍干燥存活率因素為蔗糖、葡萄糖、明膠、脫脂乳、 海藻糖、MnSO 4 · H20、甘油或谷氨酸鈉中的一種或幾種；
[0014] 細(xì)胞存活率的計(jì)算方法為：
[0015] 細(xì)胞存活率=(凍干后Ig樣品中測(cè)得的活菌數(shù)X粉劑重量V(凍干前ImL樣品 中測(cè)得的活菌數(shù)X混懸液體積）X 100%
[0016] 步驟（3)篩選出的重要因素為蔗糖、明膠和甘油，且保護(hù)劑中蔗糖與明膠與甘油 的重量比為4. 85:3:2. 84。
[0017] 步驟（4)檢測(cè)方法為按菌藻1:9的接種量投入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的柵藻的藻液中，每 隔12h測(cè)定葉綠素 a含量，計(jì)算出冷凍干燥NP23菌液對(duì)柵藻的溶藻率；
[0018] 本發(fā)明保護(hù)劑制備冷凍干燥菌液的具體做法是：10°c離心收集菌體，加入一定體 積無菌水，調(diào)菌濃至IX l〇1(lCFU/ml，取菌液加入制備好的保護(hù)劑中，保護(hù)劑與菌液的體積比 為 3:1〇
[0019] 本發(fā)明利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)活菌制劑是多種保藏方法中較為理想的一種。 單一的保護(hù)劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以抗凍保護(hù)劑一般都是按一定配方混合使 用。只有復(fù)配保護(hù)劑中各保護(hù)劑的比例及濃度達(dá)到協(xié)調(diào)時(shí)，才能達(dá)到最佳的保護(hù)效果。響 應(yīng)面方法（response surface methodology, RSM)是一種有效的多變量系統(tǒng)尋優(yōu)的試驗(yàn)策 略，通常和Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)用來實(shí)現(xiàn)對(duì)某種配方或工藝關(guān)鍵控制參數(shù)的篩選和優(yōu) 化，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表述方面更加優(yōu)良。本實(shí)驗(yàn)用Plackett-Burman法和響應(yīng)面方法擬 合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，得到準(zhǔn)確有效的一個(gè)穩(wěn)定的工藝條件。
[0020] 本發(fā)明的有益效果為：應(yīng)用響應(yīng)面方法優(yōu)化出溶藻菌的抗凍保護(hù)劑及其濃度。 用此配方保護(hù)劑保護(hù)凍干樣品時(shí)，能使細(xì)胞存活率達(dá)到91. 765%，對(duì)柵藻的溶藻率達(dá)到 97. 3%〇
【附圖說明】
[0021] 圖1是溶藻菌NP23在250ml三角瓶的的生長(zhǎng)曲線；
[0022] 圖2溶藻菌NP23在15L發(fā)酵罐的生長(zhǎng)曲線；
[0023] 圖3是Xl (蔗糖）和X2 (明膠）響應(yīng)面法響應(yīng)面圖；
[0024] 圖4是Xl (蔗糖）和X2 (明膠）響應(yīng)面法等高線圖；
[0025] 圖5是Xl (蔗糖）和X3 (甘油）響應(yīng)面法響應(yīng)面圖；
[0026] 圖6是Xl (蔗糖）和X3 (甘油）響應(yīng)面法等高線圖；
[0027] 圖7是X2 (明膠）和X3 (甘油）響應(yīng)面法響應(yīng)面圖；
[0028] 圖8是X2 (明膠）和X3 (甘油）響應(yīng)面法等高線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 一種優(yōu)化溶藻菌NP23菌粉保護(hù)劑配方工藝方法，具體按照以下步驟實(shí)施：
[0032] 步驟1 :測(cè)溶藻菌NP23在三角瓶和發(fā)酵罐的生長(zhǎng)曲線及菌的濃度。
[0033] 把搖瓶培養(yǎng)的種子按接菌量為10%，接種三角瓶和發(fā)酵罐后，以剛接種時(shí)為Oh記 時(shí)，每3h取樣分析，以空白培養(yǎng)基做對(duì)照，在分光光度計(jì)上660nm波長(zhǎng)處測(cè)菌液OD值，繪制 發(fā)酵液中溶藻菌生長(zhǎng)曲線，確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以MRS培養(yǎng)基為技術(shù)培養(yǎng)基，采用梯度稀釋平 板法計(jì)數(shù)。結(jié)合圖1和圖2可知NP23細(xì)菌在15L發(fā)酵罐生長(zhǎng)時(shí)，停滯期為0-9h左右，對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期為9-18h，在18h (菌濃達(dá)到5. 3 X IO13Cfu · πιΓ1)適合接種到藻液及制備粉劑，然后 菌體數(shù)量不再有明顯增加，最后進(jìn)入穩(wěn)定期。在250mL搖瓶發(fā)酵中，NP23菌株的停滯期在 0-12h左右，在12h (菌濃達(dá)到7. 3X1013cfu · ml-1)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至大約21h后 可達(dá)到穩(wěn)定期。和在三角瓶條件下相比，NP23細(xì)菌在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)能較快達(dá)到對(duì)數(shù)期， 可能是因?yàn)榘l(fā)酵罐中通氣條件良好，菌株生長(zhǎng)較快；但菌濃沒有三角瓶條件下高。
[0034] 步驟2 :采用Plackett-Burman(PB)法篩選出影響溶藻菌真空冷凍干燥存活率的 重要因素。
[0035] Plackett一Burman (PB)法能用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，以從眾多的 考察因素中快速有效地篩選最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研宄。根據(jù)對(duì)溶藻細(xì)菌NP23發(fā) 酵特性的研宄，選用對(duì)抗真空冷凍干燥溶藻菌保護(hù)劑蔗糖、葡萄糖、明膠、脫脂乳、海藻糖、 MnSO4 · H20、甘油、谷氨酸鈉8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分別取2個(gè)水平，低和高水平，響 應(yīng)值為溶藻菌存活率Y(% )(在無菌條件下，把發(fā)酵結(jié)束的菌體，l〇°C離心收集菌體，加保 護(hù)劑放在已滅菌的培養(yǎng)皿中，迅速在-80°C的冰箱里預(yù)冷凍12h，然后再在真空冷凍干燥機(jī) 中冷凍干燥48h，分別測(cè)定其存活率，活菌數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)）為試驗(yàn)指標(biāo)。細(xì)胞 存活率=(凍干后Ig樣品中測(cè)得的活菌數(shù)X粉劑重量V(凍干前ImL樣品中測(cè)得的活菌 數(shù)X混懸液體積）X 100%。篩選因素的可信度都在90%以上的因素做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。
[0036] 表1實(shí)驗(yàn)因素水平編碼
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 測(cè)溶藻菌NP23在發(fā)酵罐的生長(zhǎng)曲線及濃度； 2) 采用Plackett-Burman法篩選出影響溶藻菌真空冷凍干燥存活率的重要因素； 3) 篩選出的重要因素在最佳值區(qū)域里用響應(yīng)面方法擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān) 系，確定最佳配比條件； 4) 檢測(cè)優(yōu)化后溶藻菌NP23真空冷凍干燥保護(hù)劑菌粉的溶藻效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，其特征在 于：步驟（1)中具體通過分光光度計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)菌液OD值繪制發(fā)酵液中溶藻菌生長(zhǎng) 曲線，確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，所采用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，其特征在 于：步驟（2)中影響溶藻菌真空冷凍干燥存活率因素為蔗糖、葡萄糖、明膠、脫脂乳、海藻 糖、MnSO4 ?H20、甘油或谷氨酸鈉中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，其特征 在于：步驟（3)篩選出的重要因素為蔗糖、明膠和甘油，且蔗糖與明膠與甘油的重量比為 4. 85:3:2. 84。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，其特征在 于：步驟（4)檢測(cè)方法為按菌藻1:9的接種量投入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的柵藻的藻液中，每隔12h 測(cè)定葉綠素a含量，計(jì)算出冷凍干燥NP23菌液對(duì)柵藻的溶藻率。
【專利摘要】一種優(yōu)化凍干溶藻細(xì)菌NP23菌粉保護(hù)劑的方法，包括溶藻細(xì)菌NP23生長(zhǎng)曲線測(cè)定、活菌計(jì)數(shù)、存活率計(jì)算、真空冷凍干燥、溶藻率計(jì)算、Plackett-Burman(PB)法篩選主要因素、響應(yīng)面方法擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系等，采用這些方法，應(yīng)用Plackett-Burman法篩選主要因素為蔗糖、明膠、甘油；響應(yīng)面方法優(yōu)化出溶藻菌的抗凍保護(hù)劑濃度，用此配方保護(hù)劑保護(hù)凍干樣品時(shí)，能使細(xì)胞存活率達(dá)到91.765％，在108h，對(duì)柵藻的溶藻率達(dá)到97.3％。
【IPC分類】A01P13-00, A01N63-00, C12N1-04
【公開號(hào)】CN104726336
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510089574
【發(fā)明人】廖春麗, 單林娜, 萬亞濤, 郭端強(qiáng), 鞠慧麗, 方改霞, 姬曉娜
【申請(qǐng)人】河南城建學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日