一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物學技術領域，涉及一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng) 方法。
【背景技術】
[0002] 維氏氣單胞菌又稱維羅納氣單胞菌，屬弧菌科氣單胞菌屬，是一種普遍存在于淡 水、污水，土壤乃至海水中的革蘭氏陰性桿菌，該菌可產(chǎn)生一系列的毒力因子，如氣溶素 (aerolysin)、腸毒素（enterotoxin)和粘附因子（adherence factor)等。維氏氣單胞菌 夏、秋兩季繁殖快，特別在水質(zhì)惡化、水產(chǎn)動物機體創(chuàng)傷或免疫力降低情況下，患病動物以 出血和腹水為主要病理特征，死亡率很高。人被感染后可發(fā)生急性腹瀉，也可能引起菌血 癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等。維氏氣單胞菌通過污染畜禽肉類、海產(chǎn)品和蔬菜感染人，已逐漸 成為威脅人類健康的重要病原菌。目前，對維氏氣單胞菌的研宄還處于初期階段，研宄中使 用的培養(yǎng)基還是通用培養(yǎng)基配方，細菌生長較差。本發(fā)明為一種優(yōu)化的維氏氣單胞菌液體 發(fā)酵培養(yǎng)基，可大幅提高維氏氣單胞菌液體發(fā)酵生產(chǎn)率。
[0003] 本研宄以自爆發(fā)性出血病的草魚體內(nèi)分離得到的維氏氣單胞菌Wl株作為培養(yǎng)菌 株，對影響致病性維氏氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源和K 2HPO4濃度5個因 素進行了單因素試驗測定，在單因素實驗的基礎上進行了第一次正交實驗，確定了培養(yǎng)致 病性維氏氣單胞菌的最適溫度、碳源、氮源和K 2HPO4濃度。然后進一步測定了第一次試驗 選定的碳源、氮源的不同濃度和PH值對該菌發(fā)酵的影響，并在此基礎上完成了 2次正交實 驗。確定該菌最適培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉0. 4%，酵母浸粉1. 6%，K2HPO4濃度0. 1%，調(diào) pH4. 5。培養(yǎng)方案為將按上述配方配置培養(yǎng)基分裝250mL錐形瓶，接種，置于27°C，160rpm 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，22h培養(yǎng)完成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，解決了目前維氏氣 單胞菌液體發(fā)酵生產(chǎn)率較低的問題。
[0005] 技術方案為按照以下步驟進行制備：
[0006] 步驟1 :稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸粉16重量份，K2HPO4I重量份，補充水分 至1000重量份；
[0007] 步驟2 :混合步驟1所準備的原料，調(diào)整pH值為4. 5,分裝入250mL錐形瓶中；
[0008] 步驟3 :115°C滅菌30min后冷卻，完成制備過程。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行維氏氣單 胞菌培養(yǎng)的方法。
[0010] 技術方案為按照以下步驟進行：
[0011] 步驟1 :稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸膏16重量份，K2HPO4I重量份，補充水分 至1000重量份；
[0012] 步驟2 :調(diào)整pH值為4· 5,分裝入250ml錐形瓶中；
[0013] 步驟3 :115°C條件下滅菌30min后冷卻，放入維氏氣單胞菌；
[0014] 步驟4 :發(fā)酵溫度為27°C，160rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)22h。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是可大幅提高維氏氣單胞菌液體發(fā)酵生產(chǎn)率。
【附圖說明】
[0016] 圖1是不同溫度對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響示意圖；
[0017] 圖2是不同PH值對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖；
[0018] 圖3是不同碳源對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖；
[0019] 圖4是不同氮源對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖；
[0020] 圖5是不同K2HPO4濃度對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖；
[0021] 圖6是不同可溶性淀粉濃度對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖；
[0022] 圖7是不同酵母浸粉濃度對維氏氣單胞菌發(fā)酵的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0024] 本發(fā)明的目的是提供一種高效的維氏氣單胞菌培養(yǎng)方案，為實現(xiàn)對該菌的大規(guī)模 培養(yǎng)及大規(guī)模疫苗制備提供技術基礎。本發(fā)明一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵用培養(yǎng)基，該 培養(yǎng)基適用于維氏氣單胞菌的發(fā)酵，有利于維氏氣單胞菌的大量、快速生長繁殖。該培養(yǎng)基 的制備方法為：稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸粉16重量份，K 2HPO4I重量份，補充水分至 1000重量份，以上原料混合，調(diào)整pH值為4. 5,分裝入250mL錐形瓶中，115°C滅菌30min后 冷卻即得發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0025] 本發(fā)明實驗材料：維氏氣單胞菌菌株W1，自爆發(fā)性出血病的草魚體內(nèi)分離。
[0026] 胰酪胨培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g，磷酸氫二鉀2. 5g，葡萄糖2. 5g，NaCl 5g，蒸餾水 1000 mL? pH 7. 5〇
[0027] 1.維氏氣單胞菌培養(yǎng)中培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源和K2HPO4濃度的選擇
[0028] I. I. 1菌種的活化與制備
[0029] 取Wl斜面菌種，于LB瓊脂平板劃線接種，28°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種盛有上述 培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中（pH 7. 5)，28°C、160rpm搖床培養(yǎng)24h。以后所有試驗菌種均按照 此方案制備，接種量均為100 μ L。
[0030] I. 1. 2培養(yǎng)溫度對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響
[0031] 取活化的菌液100 μ L，接種于放有培養(yǎng)基的IOOmL的錐形瓶中（pH 7. 5)，分別設 定培養(yǎng)溫度為21°C、24°C、27°C、30°C、33°C、36°C，于160rpm恒溫震蕩培養(yǎng)22h。培養(yǎng)結(jié)束 后取20mL，lOOOOrpm、15min、4°C冷凍離心，然后加生理鹽水離心清洗2次，重懸后測OD值 (600nm)。每個處理3個重復，取平均值。
[0032] I. 1. 3培養(yǎng)基pH對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響
[0033] 配置 pH 值為 4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的培養(yǎng)基 8 組，接種活化的 菌液100 μ L，于160rpm，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)22h。培養(yǎng)結(jié)束后取20mL，lOOOOrpm、15min、4°C 冷凍離心，然后加生理鹽水離心清洗2次，重懸后測OD值（600nm)。每組3個重復，取平均 值。
[0034] I. I. 4培養(yǎng)基中不同碳源對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響
[0035] 將培養(yǎng)基內(nèi)碳源（葡萄糖）分別設定為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉5 組，比例均為l〇g/L，其余成分不變。于pH 7. 5、160rpm，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)22h。培養(yǎng)結(jié)束 后取20mL，lOOOOrpm、15min、4°C冷凍離心，然后加生理鹽水離心清洗2次，重懸后測OD值 (600nm)。每組3個重復，取平均值。
[0036] I. 1. 5培養(yǎng)基中不同氮源對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響
[0037] 將培養(yǎng)基內(nèi)氮源（胰蛋白胨）分別設定為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆蛋白 胨4組，比例均為10g/L，其余成分不變。于pH 7. 5、160rpm，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)22h。培養(yǎng) 結(jié)束后取20mL，lOOOOrpm、15min、4°C冷凍離心，然后加生理鹽水離心清洗2次，重懸后測OD 值（600nm)。每組3個重復，取平均值。
[0038] I. 1. 6培養(yǎng)基中K2HPO4濃度對維氏氣單胞菌培養(yǎng)的影響
[0039] 將培養(yǎng)基內(nèi)1(2冊04配制成為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的濃度5組，調(diào)培養(yǎng) 基ρΗ7· 5,于160rpm，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)22h。培養(yǎng)結(jié)束后取20mL，lOOOOrpm、15min、4°C冷 凍離心，然后加生理鹽水離心清洗2次，重懸測OD值（600nm)。每組3個重復，取平均值。
[0040] 1. 2正交試驗選擇維氏氣單胞菌的最佳發(fā)酵因素
[0041] 1. 2. 1根據(jù)pH梯度試驗表明，pH 5時生長量最大，培養(yǎng)基pH由5. 5變化到7. 0對 維氏氣單胞菌生長影響不明顯，因此固定培養(yǎng)基PH值為5.0,根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計4因 素3水平正交試驗，采用碳源、氮源、溫度、Κ 2ΗΡ04濃度4個因素，分別設計3個水平（表1)， 采用L9 (34)表完成正交試驗（表2)，探索最佳發(fā)酵條件。
[0042] 表1正交試驗因素水平表
[0043]
【主權項】
1. 一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于：按照以下步驟進行制備： 步驟1 :稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸粉16重量份，K2HPO4I重量份，補充水分至 1000重量份； 步驟2 :混合步驟1所準備的原料，調(diào)整pH值為4. 5,分裝入250mL錐形瓶中； 步驟3 :115°C滅菌30min后冷卻，完成制備過程。
2. -種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行維氏氣單胞菌培養(yǎng)的方法，其特征在于： 按照以下步驟進行： 步驟1 :稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸膏16重量份，K2HPO4I重量份，補充水分至 1000重量份； 步驟2 :調(diào)整pH值為4. 5,分裝入250ml錐形瓶中； 步驟3 :115°C條件下滅菌30min后冷卻，放入維氏氣單胞菌； 步驟4 :發(fā)酵溫度為27°C，160rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)22h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種維氏氣單胞菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)基適用于維氏氣單胞菌的發(fā)酵，有利于維氏氣單胞菌的大量、快速生長繁殖。該培養(yǎng)基的制備方法為：稱取可溶性淀粉4重量份，酵母浸粉16重量份，K2HPO41重量份，補充水分至1000重量份，調(diào)整pH值為4.5，分裝入250mL錐形瓶中，115℃條件下滅菌30min后冷卻即得發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵溫度為27℃。本發(fā)明的有益效果是可大幅提高維氏氣單胞菌液體發(fā)酵生產(chǎn)率。
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-01
【公開號】CN104726373
【申請?zhí)枴緾N201510110066
【發(fā)明人】劉涌濤, 康靜, 閆清華, 楊楠, 范秉琳, 周立帥, 門帥
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月13日