一種人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，特別是一種人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因其自我更新、多向分化、造血支持、免疫調(diào)節(jié)等特性而具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)，在用于解決多種血液系統(tǒng)疾病，心血管疾病，肝硬化，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破。
[0003]MSCs最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，目前，骨髓仍是MSCs的主要來(lái)源，但其獲取途徑具有侵入性，來(lái)源有限，并且骨髓來(lái)源的MSCs(bone marrow derived MSCs，BMSCs)數(shù)量、分化能力都會(huì)隨供者年齡的增長(zhǎng)而逐漸減少變差，從而限制了 MSCs的臨床應(yīng)用(Rao，2001; Grove,2004; D’Ippolito，1999)。Parolini (2008) ,Mihu (2008)等的研宄均證實(shí)，被當(dāng)做醫(yī)療垃圾丟棄的人類胎盤中存在大量的MSCs(placenta derived MSCs，PMSCs)，研宄表明PMSCs主要存在于羊膜、絨毛膜等來(lái)源于胎兒的組織，并且與絨毛的分布密切相關(guān)，多分布于絨毛內(nèi)皮下以及絨毛附近間質(zhì)內(nèi)。與BMSCs相比，PMSCs因取材方便、操作無(wú)侵入性、多向分化潛能大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、病原污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)而成為再生醫(yī)學(xué)的重要細(xì)胞來(lái)源和最具臨床應(yīng)用前景的功能干細(xì)胞。通常，PMSCs表面⑶29 (0-整合素)、^44 (纖維蛋白和透明質(zhì)酸鹽受體)陽(yáng)性，而CD34 (高度糖基化的i型跨膜糖蛋白)、CD45 (白細(xì)胞共同抗原)陰性，可用這些分子來(lái)鑒定PMSCs。
[0004]目前常用的PMSCs分離方法是將胎盤絨毛膜剪碎后直接用組織塊法培養(yǎng)，或者使用膠原酶聯(lián)合胰酶或DNA酶等消化獲得細(xì)胞懸液后再以密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀或磁珠分選法進(jìn)行分離培養(yǎng)(陸琰，2009 ;吳潔瑩，2005 ;李棟，2007)。
[0005]PMSCs的分離方法不同，分離效果也大相徑庭，其中，組織塊方法培養(yǎng)的原代細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，且此混合細(xì)胞群中只有少量細(xì)胞符合MSCs的表面抗原表達(dá)特征；混合酶消化的方法需要對(duì)組織塊進(jìn)行多次消化，操作繁復(fù)，增加污染幾率，并且容易造成細(xì)胞損傷；因?yàn)镸SCs缺乏特異的表面標(biāo)志，所以利用流式細(xì)胞儀或磁珠分選法會(huì)損失大量細(xì)胞，并且成本高。對(duì)于PMSCs的體外培養(yǎng)，目前大多添加胎牛血清(FBS)，但臨床應(yīng)用上不允許使用動(dòng)物來(lái)源制品，只能選擇昂貴的無(wú)血清專用培養(yǎng)基，從而造成細(xì)胞培養(yǎng)成本的大幅增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有常用的PMSCs分離方法中存在的問(wèn)題與缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種新的簡(jiǎn)化了的PMSCs分離，培養(yǎng)方法，可有效地克服現(xiàn)有分離培養(yǎng)方法的不足。
[0007]其解決問(wèn)題的技術(shù)方案是:
一種人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
步驟一:用大鑷子取出胎盤，放入白瓷盤中，用生理鹽水充分洗滌，用直剪刀將胎盤上殘留的臍帶剪掉，用手術(shù)刀將羊膜切除，將胎盤切割成四塊，分裝到15cm培養(yǎng)皿中；
步驟二:用酒精棉球擦拭胎盤母體面和嬰兒面，用直剪刀將母體面組織剪掉留嬰兒面?zhèn)溆?
步驟三:剝離出胎盤絨毛，用組織剪將之剪成l_3mm3大小的組織塊后放入50ml離心管中，加入二倍體積的0.1%膠原酶I，置于37°C培養(yǎng)箱中消化15h備用；
步驟四:用100mlPBS (磷酸鹽緩沖液)稀釋步驟三消化液后200目濾網(wǎng)過(guò)濾，800g，15min離心收集細(xì)胞備用；
步驟五:棄上清后用PBS重懸細(xì)胞，500g，5min離心沉淀細(xì)胞；
步驟六:使用添加有5%組成為:3%-6%結(jié)合蛋白；0.5%-1.5%生長(zhǎng)因子；0.5%-1.5% (組氨酸:脯氨酸3:1) ；0.03%-0.07%固醇類激素;0.1%-0.5%【(維生素B1:維生素B2:維生素B6:維生素B12 1:1:1:1):維生素C:維生素D:維生素E 1:1:1:1】；0.01%_0.03% (鐵:鋅:鉬:鈷2:2:1:1) ；0.5%-1.5%粘附因子；87.4%_95.36%去離子水的血清替代物MEM-α培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于1cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3-4d后添加新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用0.05%胰酶消化，傳代培養(yǎng)；
步驟七:待細(xì)胞擴(kuò)增至3-6X 17個(gè)時(shí)用0.05%胰酶消化，800g，15min離心收集細(xì)胞，用新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基重懸，加入凍存保護(hù)劑并使用程序降溫儀凍存細(xì)胞，程序?yàn)?以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，結(jié)束后放入液氮中凍存。
[0008]這種將絨毛剝出后再用膠原酶I 一步消化法分離PMSCs，能夠減少操作步驟，減輕細(xì)胞損傷，有效提高目的細(xì)胞所占的比例，減少其他細(xì)胞的污染；這種細(xì)胞貼壁篩選方法，簡(jiǎn)單易行，并且能夠逐代純化細(xì)胞；使用含5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，能夠?qū)⑸a(chǎn)成本降低至少50% ;原代培養(yǎng)的細(xì)胞以集落方式生長(zhǎng)，6-9d后接近80%融合，傳代后細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞形態(tài)較原代均一，呈均質(zhì)長(zhǎng)梭形，由細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果可知，在第一代細(xì)胞中，目的細(xì)胞的含量即可達(dá)到85%左右；從而縮短了細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)間并使細(xì)胞純度得到提高，能夠大幅降低成本并能很好維持PMSCs原始狀態(tài)，為PMSCs的大量制備以及將來(lái)廣闊的臨床應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0009]以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)發(fā)明作出詳細(xì)的說(shuō)明實(shí)施例一
一種人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
步驟一:用大鑷子取出胎盤，放入白瓷盤中，用生理鹽水充分洗滌，用直剪刀將胎盤上殘留的臍帶剪掉，用手術(shù)刀將羊膜切除，將胎盤切割成四塊，分裝到15cm培養(yǎng)皿中；
步驟二:用酒精棉球擦拭胎盤母體面和嬰兒面，用直剪刀將母體面組織剪掉；
步驟三:剝離出胎盤絨毛，用組織剪將之剪成l_3mm3大小的組織塊后放入50ml離心管中，加入二倍體積的0.1%膠原酶I，置于37°C培養(yǎng)箱中消化15h ；
步驟四:用100mlPBS (磷酸鹽緩沖液)稀釋后200目濾網(wǎng)過(guò)濾，800g，15min離心收集細(xì)胞； 步驟五:棄上清后用PBS重懸細(xì)胞，500g，5min離心沉淀細(xì)胞；
步驟六:使用添加有5%組成為:3%結(jié)合蛋白；0.5%生長(zhǎng)因子；0.5%非必須氨基酸(組氨酸:脯氨酸3:1) ;0.03%固醇類激素；0.1%【(維生素B1:維生素B2:維生素B6:維生素B12 I:1:1:1):維生素 C:維生素 D:維生素 E I:1:1:1]；0.01% (鐵:鋅:鉬:鈷 2:2:1:I) ；0.5%粘附因子；95.36%去離子水的MEM- α培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于1cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3-4d后添加新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用0.05%胰酶消化，傳代培養(yǎng)；
步驟七:待細(xì)胞擴(kuò)增至3-6X 17個(gè)時(shí)用0.05%胰酶消化，800g，15min離心收集細(xì)胞，用新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基重懸，加入凍存保護(hù)劑并使用程序降溫儀凍存細(xì)胞，程序?yàn)?以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，結(jié)束后放入液氮中凍存。
[0010]實(shí)施例二
一種人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
步驟一:用大鑷子取出胎盤，放入白瓷盤中，用生理鹽水充分洗滌，用直剪刀將胎盤上殘留的臍帶剪掉，用手術(shù)刀將羊膜切除，將胎盤切割成四塊，分裝到15cm培養(yǎng)皿中；
步驟二:用酒精棉球擦拭胎盤母體面和嬰兒面，用直剪刀將母體面