血管內皮細胞的快速提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域中血管內皮細胞的快速提取方法。
【背景技術】
[0002]在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤血管在此過程中所扮演的角色至關重要。當瘤體生長到Imm3大小時，就分泌了大量的血管內皮細胞生長因子VEGF，誘使瘤體周圍生長出許多自己專屬的腫瘤新生血管。這些腫瘤血管呈奇特的螺旋狀，連接在正常血管上，在形態(tài)、功能、蛋白質表達、對細胞因子的反應性及遺傳學水平上，它與正常血管存在明顯差異。
[0003]腫瘤血管新生分為血管生成(ang1enesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)，前者是宿主成熟血管發(fā)展而來，后者則是由骨髓或循環(huán)系統(tǒng)中的內皮祖細胞，在腫瘤微環(huán)境中各種細胞因子的刺激下，定向誘導分化而來。除此之外，腫瘤血管還存在血管共生(vesselco opt1n)和血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry)兩種形式。血管擬態(tài)多見于侵襲性較高的腫瘤組織，其內不含內皮細胞，完全由腫瘤細胞構成，在結構和功能上類似血管，被看作是腫瘤組織的另一套循環(huán)系統(tǒng)。
[0004]以腫瘤供養(yǎng)血管網為靶點的藥物是提高腫瘤治愈率的一種新方法。正是這種固有差異為新藥物的設計和治療策略的高度選擇性提供了多種獨特的靶點。但是在現(xiàn)有的腫瘤血管內皮細胞提取方法上，不能獲得大量的腫瘤血管內皮細胞，為研宄其機制及作用帶來很大的影響。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是如何提高提取腫瘤血管內皮細胞的提取量及質量。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了腫瘤血管內皮細胞的提取方法。
[0007]本發(fā)明所提供的腫瘤血管內皮細胞的提取方法，包括SI)和S2):
[0008]SI)用眼科剪剪碎離體的腫瘤組織得到腫瘤單細胞；
[0009]S2)分選所述腫瘤單細胞得到所述腫瘤血管內皮細胞。
[0010]上述方法中，所述眼科剪又稱眼科手術剪、眼用手術剪，是剪切眼部軟組織用的器械。所述眼科剪可為頭端寬0.4毫米，尖而不銳的眼科剪；所述眼科剪也可為頭端寬1.6毫米的眼科剪。
[0011]所述眼科剪具體可為張家港市大都醫(yī)療器械有限公司的型號為YYJ-PT > 1cm的彎剪。
[0012]所述離體的腫瘤組織可在PBS中浸泡1-3分鐘后用所述眼科剪剪碎得到所述腫瘤單細胞。
[0013]上述方法中，所述SI)可包括Al)和A2):
[0014]Al)用所述眼科剪剪碎所述離體的腫瘤組織得到破碎腫瘤組織；
[0015]A2)向所述破碎腫瘤組織中加入酶進行消化得到所述腫瘤單細胞。
[0016]所述破碎腫瘤組織的大小可為0.027-0.125mm3,具體可為(0.3-0.5)mmX (0.3-0.5)mmX (0.3-0.5)mm。
[0017]上述方法中，所述用所述眼科剪剪碎所述離體的腫瘤組織得到破碎腫瘤組織還可包括向所述離體的腫瘤組織和/或所述破碎腫瘤組織上添加PBS的步驟。
[0018]上述方法中，所述酶可為膠原酶和/或胰酶。
[0019]上述方法中，所述A2)可包括BI)和B2):
[0020]BI)向所述破碎腫瘤組織中加入膠原酶進行消化得到膠原酶消化后的腫瘤組織；
[0021]B2)向所述膠原酶消化后的腫瘤組織中加入胰酶進行消化得到所述腫瘤單細胞。
[0022]上述方法中，所述BI)可包括C1)、C2)和C3):
[0023]Cl)向所述破碎腫瘤組織中加入膠原酶溶液得到膠原酶-腫瘤組織混合物；
[0024]C2)將所述膠原酶-腫瘤組織混合物在震蕩器上進行震蕩，得到震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物；
[0025]C3)將所述震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物在37°C孵育，得到所述膠原酶消化后的腫瘤組織。
[0026]上述方法中，C2)所述震蕩的時間可為3-5分鐘。C2)所述震蕩的頻率可為1500-2000rpm，具體可為1700rpm。C3)所述孵育可在37°C水浴鍋中進行；所述孵育的時間可為1-3分鐘。
[0027]上述方法中，所述C2)和所述C3)可交替進行10-15次。
[0028]上述方法中，所述膠原酶可為膠原酶I。
[0029]上述方法中，所述膠原酶溶液可為膠原酶I溶液。所述膠原酶I溶液可為向DMEM完全培養(yǎng)基中加入胎牛血清(FBS)和P/S得到的溶液，其中所述胎牛血清的體積百分比濃度為10%，所述P/S的體積百分比濃度為1%。所述P/S為向超純水(DDH2O)中加入膠原酶1、青霉素和鏈霉素得到溶液。所述P/S中膠原酶I的濃度可為10mg/ml，所述青霉素的濃度可為100u/ml，所述鏈霉素的濃度可為100u/ml。所述膠原酶I溶液中膠原酶I的濃度可為 1000mg/ml。
[0030]所述DMEM完全培養(yǎng)基具體可為Gibco公司產品，貨號為11995-065。所述胎牛血清具體可為Gibco公司產品，貨號為10099-141。所述膠原酶I具體可為北京索萊寶科技有限公司產品，貨號為C8140-100。
[0031]上述方法中，所述方法還包括將所述膠原酶消化后的腫瘤組織進行洗滌的步驟。所述洗滌可用PBS進行。
[0032]上述方法中，所述B2)可包括Dl)和D2):
[0033]Dl)向所述膠原酶消化后的腫瘤組織中加入胰酶得到胰酶-腫瘤組織混合物；
[0034]D2)將所述胰酶-腫瘤組織混合物在震蕩器上進行震蕩，得到所述腫瘤單細胞。
[0035]上述方法中，D2)所述震蕩的時間可為8-12分鐘。所述震蕩的頻率可為1500-2000rpm，具體可為 1700rpm。
[0036]上述方法中，所述胰酶可為胰酶溶液。所述胰酶溶液可為向DDH2O中加入NaCl、NaHCO3、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，所述NaCl的濃度可為0.8g/ml，所述NaHCO3的濃度可為0.05g/ml，所述葡萄糖的濃度可為0.lg/ml，所述EDTA的濃度可為0.03g/ml，所述胰酶的濃度可為0.25g/mlo
[0037]上述方法中，所述方法還包括將所述腫瘤單細胞進行洗滌的步驟。所述洗滌可用PBS進行。
[0038]上述方法中，所述提取方法中可利用免疫磁珠法分選所述腫瘤單細胞得到所述腫瘤血管內皮細胞。所述利用免疫磁珠法分選所述腫瘤單細胞所用免疫磁珠偶聯(lián)CD105抗體。
[0039]上述方法中，所述利用免疫磁珠法分選所述腫瘤單細胞的具體方法可包括Hl)、H2)和 H3):
[0040]Hl)用溶液A重懸所述腫瘤單細胞得到腫瘤單細胞懸浮液；
[0041]H2)向所述溶液A中加入磁珠分離液，混合均勻后于磁力架上放置后棄上層液體，用所述溶液A重懸沉淀得到磁珠混懸液；
[0042]H3)將所述腫瘤單細胞懸浮液和所述磁珠混懸液混合后進行細胞的分選，去除所述磁珠得到所述腫瘤血管內皮細胞。
[0043]其中，所述腫瘤單細胞懸浮液和所述磁珠懸浮液的體積比可為9:1。所述溶液A可為向0.0lM PBS中加入BSA得到的溶液，所述溶液A中所述BSA的濃度可為0.lmg/100mL.
[0044]上述方法中，所述去除所述磁珠具體可用release buffer去除。
[0045]其中，所述release buffer具體可為德國美天旎生物技術有限公司(MACS)產品，貨號為 130-051-201。
[0046]上述方法中，所述方法還包括將所述腫瘤單細胞過篩子進行過濾的步驟。所述篩子具體可為80目的篩子。
[0047]上述方法中，所述腫瘤可為惡性腫瘤，如肺癌和/或肝癌和/或腸癌和/或前列腺癌和/或胰腺癌等。所述腫瘤可為人肺腺癌。所述腫瘤具體可為在SCID小鼠上生長的人肺腺癌。
[0048]本發(fā)明中，所述PBS可為0.0IM PBS。
[0049]本發(fā)明中，所述震蕩器可為IKA產品，型號為VORTXl。
[0050]本發(fā)明中，所述眼科剪也可用其他將腫瘤組織充分剪碎的工具替代。
[0051 ] 實驗證明，利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法得到的腫瘤血管內皮細胞純度非常高，腫瘤血管內皮細胞高表達⑶105，表達率為97.3%。成管實驗結果顯示腫瘤血管內皮細胞抱團形成管腔，此為血管內皮細胞的一個重要特征，而Dil-acLDL實驗結果也顯示腫瘤血管內皮細胞可以吞噬Dil-acLDL，表明腫瘤血管內皮細胞具有內皮細胞的功能，表明利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法得到的細胞為腫瘤血管內皮細胞。本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法提取血管內皮細胞所需時間短，2-3小時時間即可完成腫瘤血管內皮細胞的提取。實驗證明，可利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法提取腫瘤血管內皮細胞。
【附圖說明】
[0052]圖1為從荷瘤小鼠剝離得到的腫瘤組織。
[0053]圖2為用眼科剪充分剪碎腫瘤組織得到的剪碎的腫瘤組織。
[0054]圖3為腫瘤血管內皮細胞的提取過程中用到的振蕩器和水浴鍋。其中，A為振蕩器；B為水浴鍋。
[0055]圖4為將分選得到的腫瘤血管內皮細胞進行培養(yǎng)得到的貼壁的腫瘤血管內皮細胞。
[0056]圖5為利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法得到的腫瘤血管內皮細胞的⑶105的表達率。
[0057]圖6為利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法得到的腫瘤血管內皮細胞的成管實驗結果。
[0058]圖7為利用本發(fā)明的腫瘤血管內皮細胞的提取方法得到的腫瘤血管內皮細胞的Dil-acLDL吞噬實驗結果。
【具體實施方式】
[0059]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0060]下述實施例中的眼科剪為張家港市大都器械醫(yī)療有限公司的型號為YYJ-PT >1cm的彎剪。該眼科剪頭端寬0.4毫米，尖而不銳。
[0061]下述實施例中的人肺腺癌A549細胞為ATCC產品，貨號為CCL-185。
[0062]下述實施例中的SCID小鼠為北京維通利華實驗動物技術有限公司產品。
[0063]下述實施例中的胎牛血清(FBS)為Gibco產品，貨號為10099-141。
[0064]下述實施例中的膠原酶I溶液為向DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco，貨號11995-065)中加入胎牛血清(FBS，Gibco公司產品，貨號為10099-141)和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比濃度為10%，P/S的體積百分比濃度為1%。P/S為向超純水(DDH2O)中加入膠原酶I (北京索萊寶科技有限公司，貨號:C8140-100)、青霉素(索萊寶，貨號P8420)和鏈霉素(索萊寶，貨號S8290-5)得到溶液，P/S中膠原酶I的濃度可為10mg/ml，青霉素的濃度為100u/ml，鏈霉素的濃度為100u/ml。該膠原酶I溶液中膠原酶I的濃度為100mg/ml ο
[0065]下述實施例中的胰酶溶液為向DDH2O中加入NaCl、NaHC03、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，NaCl的濃度為0.8g/ml，NaHCOj^濃度為0.05g/ml，葡萄糖的濃度為0.1g/ml，EDTA的濃度為0.03g/ml，胰酶的濃度為0.25g/ml。
[0066]下述實施例中的release buffer為德國美天旎生物技術有限公司(MACS)產品，貨號為 130-051-201。
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