一種木聚糖酶XynRBM26及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種木聚糖酶XynRBM26 及其編碼基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖是植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要組成成分，其完全水解需要木聚糖酶 和木糖苷酶等多種酶的協(xié)同作用，木聚糖酶包括內(nèi)切-I，4_f3-D-木聚糖酶（endo-1， 4_β -D_xylanase，EC 3. 2. 1. 8)和 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase， EC 3· 2.I.55)等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)。內(nèi)切-1， 4- β -D-木聚糖酶能水解木聚糖主鏈的β -I，4糖苷鍵，是木聚糖降解過(guò)程中發(fā)揮最主要作 用的酶。由于木聚糖酶具有降解植物木聚糖的作用，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、釀酒、造紙、 麻類(lèi)脫膠和燃料生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域。
[0003] 植食性動(dòng)物胃腸道中存在豐富的與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的多種酶類(lèi)，但不同動(dòng) 物之間存在差異（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012， 7:e40430)。近年來(lái)，研宄者通過(guò)微生物分離培養(yǎng)和宏基因組學(xué)等方法從天牛胃腸道、奶牛 瘤胃、山羊瘤胃等動(dòng)物中獲取了多種木聚糖酶（Zhou et al. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011,38:523-530 ；Cheng et al. J Agric Food Chem,2012,60:12516-12524 ；ffang et al. Bioresour Technol，2011，102:3330-3336)。漬金絲猴（Rhinopithecus bieti)是典型 的植食性靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，由于攝食種類(lèi)和物種的差異，其胃腸道中可能蘊(yùn)含有不同于其它動(dòng) 物的新的微生物木聚糖酶基因資源，但到目前為止，還未見(jiàn)滇金絲猴胃腸道微生物來(lái)源相 關(guān)酶基因的報(bào)道。
[0004] 木聚糖酶來(lái)源比較廣泛，在細(xì)菌、真菌、陸地植物組織中都存在（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005, 29:3-23)，其中微生物主要來(lái)源于芽孢桿菌屬（Bacillus)、 曲霉屬（Aspergillus)、里氏木霉屬（Trichoderma)等，然而來(lái)自Massilia的木聚糖 酶尚未見(jiàn)報(bào)道。不同菌屬來(lái)源的木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)差異較大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem，2000,64:1230-1237 ;Gessesse et al. Appl Environ Microbiol， 1998,64:3533-3535)，因此研宄鑒定不同來(lái)源的木聚糖酶對(duì)其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述木聚糖酶的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組表達(dá)載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明從滇金絲猴糞便中分離到Massilia sp. RBM26,通過(guò)基因組測(cè)序，獲得第10 家族的木聚糖酶編碼基因，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)和重組酶的酶學(xué)特性分析， 發(fā)現(xiàn)獲得的木聚糖酶XynRBM26在高濃度NaCl下仍然具有催化活性，可應(yīng)用于高鹽食品和 海產(chǎn)品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，且本發(fā)明中的木聚糖酶來(lái)源于動(dòng)物胃腸道，因 此其性質(zhì)具有進(jìn)一步應(yīng)用于飼料等領(lǐng)域的潛力。
[0010] 本發(fā)明所述木聚糖酶XynRBM26可得自Massilia sp. RBM26,其編碼基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明所述木聚糖酶XynRBM26的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共383個(gè)氨基 酸，其理論分子量為43. 17kDa。
[0012] 本發(fā)明的木聚糖酶XynRBM26的最適pH值為5. 5，在ρΗ5· 0-7. 0之間可以保持90 % 以上的酶活性；在pH5. 0-10. 0的緩沖液處理lh，酶活力剩余82%以上；最適反應(yīng)溫度為 45°C，在37°C、45°C和50°C下處理lh，剩余酶活分別為95. 6%、81. 2%和59. 7% ;反應(yīng)體系 中0. 5-1. 5M的NaCl對(duì)酶活影響較小，在5M時(shí)仍可以保持86%的活性；經(jīng)0. 5-5M的NaCl 在37°C下處理lh，發(fā)現(xiàn)0.5-3. 5M的NaCl可提高酶活；在反應(yīng)體系中加入10% (v/v)的乙 醇進(jìn)行酶促反應(yīng)，可保持50 %的酶活性，酶經(jīng)3. 0-15. 0% (v/v)的乙醇在37°C下處理lh， 該酶仍能保持80%左右的酶活性；在pH5. 5及45°C下該酶對(duì)0. 5% (w/v)的燕麥木聚糖、 山毛櫸木聚糖能有效地水解，而不能水解羧甲基纖維素鈉、昆布多糖和β -葡聚糖、微晶纖 維素、p-nitrophenyl- β -D_xylopyranoside〇
[0013] 本發(fā)明通過(guò)基因組測(cè)序的方法克隆了木聚糖酶的編碼基因 XynRBM26,其全長(zhǎng)為 1152bp，起始密碼為ATG，終止密碼為T(mén)GA。
[0014] 本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重組載體，優(yōu)選為 pEasy-E2-XynRBM26。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體中，使其核苷酸序列與表達(dá) 調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明木聚糖酶基因和表達(dá)載 體pEasy-E2通過(guò)T-A方式相連接，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pEasy-E2_XynRBM26。
[0015] 本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為 大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3)/XynRBM26。
[0016] 本發(fā)明制備木聚糖酶XynRBM26的方法按以下步驟進(jìn)行：
[0017] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0018] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶基因 XynRBM26表達(dá)；
[0019] 3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XynRBM26。
[0020] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /XynRBM26。
[0021] 本發(fā)明提供了一個(gè)新的木聚糖酶基因，其編碼的木聚糖酶最適pH為5. 5,最適溫 度為45°C，在反應(yīng)體系中加入5M的NaCl仍然具有86%的酶活，酶經(jīng)2M NaCl在37°C下處 理lh，活性高達(dá)120%;該酶能有效地水解燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖，而不能水解羧甲基纖 維素鈉、昆布多糖和β _葡聚糖、微晶纖維素、P_nitrophenyl- β -D-xylopyranoside。以上 性質(zhì)表明本發(fā)明的木聚糖酶作為一種新型的酶制劑，可廣泛應(yīng)用于飼料、食品和生物燃料 等行業(yè)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1 :在大腸桿菌中表達(dá)的重組木聚糖酶XynRBM26的SDS-PAGE分析，其中，1 : 500mM咪挫洗脫親和于Nickel-NTA Agarose中的重組XynRBM26 ;M :蛋白質(zhì)Marker。
[0023] 圖2 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的pH活性。
[0024] 圖3 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的pH穩(wěn)定性。
[0025] 圖4 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的熱活性。
[0026] 圖5 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的熱穩(wěn)定性。
[0027] 圖6 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的NaCl抗性。
[0028] 圖7 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的NaCl穩(wěn)定性。
[0029] 圖8 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的乙醇抗性。
[0030] 圖9 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的乙醇穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0032] 試驗(yàn)材料和試劑
[0033] 1、菌株及載體：Massilia sp. RBM26是本研宄室2013年從我國(guó)云南省維西縣白馬 雪山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的滇金絲猴糞便微生物中分離得到，其16s rRNA基因序列比對(duì)結(jié) 果與 Massilia aurea shain AP13(NR_042502)的相似性為 99%。大腸桿菌 Escherichia coli BL21 (DE3)和表達(dá)載體pEasy-E2購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0034] 2、酶類(lèi)及其他生化試劑：DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；山毛櫸木聚糖 (Beechwood xylan)、p-nitrophenyl-β -D-xylopyranoside 購(gòu)自 Sigma 公司；燕麥木聚糖 (Xylan from oat spelts)購(gòu)自 SERVA 公司；Genomic DNA Clean&Concentration 試劑盒購(gòu) 自 Zymo Research 公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit 購(gòu)自 Illumima 公司，其 它都為國(guó)產(chǎn)試劑（均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到）。
[0035] 3、培養(yǎng)基：
[0036] LB 培養(yǎng)基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸饋水至 1000ml，pH 自 然（約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。
[0037] 說(shuō)明：以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。
[0038] 實(shí)施例1 :木聚糖酶基因 XynRBM26的克隆
[0039] 提取Massilia sp. RBM26基因組DNA:將