一種抑制人黑色素瘤RNF11基因表達(dá)的siRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的 siRNAo
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素瘤是一種由來源于神經(jīng)脊的黑色素細(xì)胞異常增生而產(chǎn)生的惡性皮膚腫瘤， 具有極高的轉(zhuǎn)移性，而且對一般化療有抗性。因此盡管黑色素瘤的發(fā)病率在皮膚癌中只 排第三位，但它的致死率是最高的，在所有皮膚癌致死的病人中，約有80%的病人死于黑 色素瘤。黑色素瘤在我國的發(fā)病率近年來成倍增長，2000年發(fā)病率統(tǒng)計僅為0. 2/10萬， 2005-2007年我國發(fā)病率約1/10萬，每年新發(fā)病例約2萬人，已經(jīng)成為嚴(yán)重危及我國人民 健康的疾病之一。雖然在黑色素瘤的發(fā)病早期，可以通過手術(shù)切除來治療，但是一旦發(fā)展到 轉(zhuǎn)移階段，目前還沒有有效的治療手段。
[0003] RNA干涉（RNA interference)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種抑制基因表達(dá)的最 有力的工具之一。此技術(shù)采用19-23個堿基或發(fā)夾狀不同長度的雙鏈RNA可使不同類型 細(xì)胞的革G向基因表達(dá)明顯降低，因此，RNAi技術(shù)可使基因敲除（knock-down)或使基因沉 默（gene silencing)。這是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS， post-transcriptional gene silencing)。這種新興的生物技術(shù)為疾病分子水平的治療提 供了新的技術(shù)和方法，在哺乳動物細(xì)胞中建立RNA干涉技術(shù)，可以用于研宄某些特定基因 的功能，從而可以解決某些疾病的發(fā)病機制，同時對疾病尤其是對腫瘤的治療也有一定的 應(yīng)用價值，并且RNA干涉技術(shù)所使用的劑量僅為反義寡核苷酸劑量的萬分之一左右。另一 方面，若小雙鏈RNA中改變1個核苷酸，就可使該RNAi靶向基因沉默作用消失，這樣，就有 可能將這一技術(shù)用于抑制某些過度表達(dá)基因的表達(dá)，而不影響正常基因的表達(dá)，因此，利用 RNA干擾技術(shù)制備基因藥物將是一種有效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的SiRNA，還提供了該SiRNA 載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA，所述的siRNA為小雙鏈RNA，其正 義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一個所示的序列。 其反義鏈序列為與相應(yīng)正義鏈序列反向互補的序列。
[0007] 優(yōu)選的，所述的siRNA的正義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 3和SEQ NO. 4。
[0008] 一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA的載體，所述載體含有能夠產(chǎn)生特 異性抑制人RNFll基因表達(dá)的siRNA ;所述的siRNA的正義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、 SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一個所示的序列。
[0009] 所述一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的SiRNA的載體的構(gòu)建方法，包括以下 步驟：
[0010] I) SiRNA對應(yīng)的DNA序列的合成
[0011] 根據(jù)序列表中任何一個siRNA的正義鏈序列，設(shè)計其對應(yīng)的DNA序列，序列兩端引 入酶切位點，所述DNA序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa序列，設(shè)計好的序列經(jīng)合 成后，通過退火形成雙鏈DNA，退火反應(yīng)采用常規(guī)方法即可；
[0012] 2)pSilencer 3. l-U6-siRNA 載體的構(gòu)建
[0013] 將pSilencer 3. 1-U6載體進(jìn)行雙酶切，所使用的兩個酶與步驟（3)中雙鏈DNA 設(shè)計酶切位點時選用的酶相同，回收目的片段，然后將回收的載體與步驟（3)中形成的雙 鏈DNA序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到陽性菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證，酶 切驗證為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗證，將經(jīng)驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pSilencer 3. l-U6-siRNA 載體。
[0014] 本發(fā)明的另一方面，一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA在制備抑制黑 色素瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，所述的siRNA的正義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、 SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一個所示的序列。
[0015] -種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA的載體作為抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移的藥 物的應(yīng)用，所述載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人RNFll基因表達(dá)的siRNA ;所述的siRNA的 正義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一個所示的序 列。
[0016] 本發(fā)明提供了一種治療黑色素瘤的藥物，所述的藥物的活性成分為：通過RNA干 擾抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA及其載體，所述的siRNA的正義鏈序列為SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4 和 SEQ NO. 5 中任意一個所示的序列。
[0017] 本發(fā)明抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA，可以有效抑制黑色素瘤的體內(nèi) 轉(zhuǎn)移，為黑色素瘤的治療提供新的靶點，為治療黑色素瘤提供了可行的藥物。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0019] 實施例1載體構(gòu)建
[0020] I) siRNA對應(yīng)的DNA序列的合成
[0021] 根據(jù)序列表SEQ NO. 1~2中任何一個siRNA的正義鏈序列，設(shè)計其對應(yīng)的DNA序 列，序列兩端引入酶切位點，所述DNA序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa序列，設(shè) 計好的序列經(jīng)合成后，通過退火形成雙鏈DNA，退火反應(yīng)采用常規(guī)方法即可。將序列表中任 何一個siRNA的正義鏈序列打亂但所含A、T、C、G含量不變作為相應(yīng)siRNA的對照。
[0022] 2)pSilencer 3. l-U6-siRNA 載體的構(gòu)建
[0023] 將pSilencer 3. 1-U6載體進(jìn)行雙酶切，所使用的兩個酶與步驟（1)中雙鏈DNA設(shè) 計酶切位點時選用的酶相同，回收目的片段，然后將回收的載體與步驟（1)中形成的雙鏈 DNA序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到陽性菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證，酶切 驗證為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗證，將經(jīng)驗證正確的重組質(zhì)粒分別命名為pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 載體-1(SEQ N01)，pSilen cer 3.1-U6-RNFll-siRNA 載體-2(SEQ N02)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA載體-3(SEQ N02)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 載體-4(SEQ N04)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 載體-5(SE Q N05)。
[0024] 實施例2黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0025] 1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0026] 人黑色素瘤細(xì)胞株HTP137和M102用含10%胎牛血清及1X105U/L青霉素、 100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37、°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn) 染實驗。
[0027] 2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0028] 按照陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen)的操作說明進(jìn)行，將 500 μ L無血清培養(yǎng)液DMEM與8 μ g pSilencer 3. l-U6-siRN A載體充分混和，與脂質(zhì)體 /DMEM混合物再次混合，將最終混合物加入培養(yǎng)在6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的黑色素瘤細(xì)胞中，在 37、°C 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至48h。
[0029] 3)實時熒光定量RT-PCR檢測
[0030] 采用Trizol試劑（Invitrogen)按照說明書提取實驗各組黑色素瘤細(xì)胞的總 RNA，紫外檢測儀分別在260nm和280nm波長下檢測RNA的濃度及純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (invitrogen)合成cDNA，以此為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增。RNFllmRNA表達(dá)量的分 析采用比較Ct數(shù)據(jù)法（2_ ΛΛ，進(jìn)行。每組實驗重復(fù)3次。
[0031] 4)細(xì)胞迀移和侵襲抑制率測定
[0032] 分別用transwell迀移和侵襲實驗測定RNFllsiRNA對人黑色素瘤ΗΤΒ137和Μ102 細(xì)胞迀移和侵襲的抑制率。在transwell迀移實驗中，首先將5 X IO5細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中 培養(yǎng)24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h，用胰酶消化并計數(shù)，將I X IO4細(xì)胞加入transwell小室 的上室，并在下室加入NIH-3T3conditioned培養(yǎng)基作為化學(xué)吸引物，培養(yǎng)24小時后，用溶 解在20%的甲醇中結(jié)晶紫固定0. 5h，然后用棉簽小心拭去未迀移到小室下方而滯留在小 室上方的細(xì)胞，在顯微鏡下對迀移到小室下方的細(xì)胞拍照并計數(shù)。transwell侵襲實驗與 transwell迀移實驗步驟基本相同，只是transwell侵襲實驗所用的transwell小室要用 Matrigel包被。細(xì)胞迀移和侵襲抑制率（％) =(對照組迀移細(xì)胞數(shù)一實驗組迀移細(xì)胞 數(shù)）/對照組迀移細(xì)胞數(shù)X100%。每組實驗重復(fù)3次。
[0033] 5)統(tǒng)計學(xué)處理
[0034] 采用SPSS 17. 0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)表示，采用 t檢驗，以P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，具體情況見表1。
[0035] 表1 48后實時定量PCR檢測各載體對RNFll表達(dá)的抑制率[RNFl 1表達(dá)的抑制率
[0036]
【主權(quán)項】
1. 一種抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA，其特征在于：所述的siRNA為小雙鏈 RNA，其正義鏈序列為SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 或SEQNO. 5 中任意一個所 示的序列。
2. 權(quán)利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA的載體，其特征在于： 所述載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人RNFll基因表達(dá)的siRNA;所述的siRNA的正義鏈序 列為SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一個所示的序列。
3. 權(quán)利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA在制備抑制黑色素瘤 轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，所述的siRNA的正義鏈序列為SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQ NO. 4和SEQNO. 5中任意一個所示的序列。
4. 權(quán)利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA的載體作為抑制黑色素 瘤轉(zhuǎn)移的藥物的應(yīng)用，所述載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人RNFll基因表達(dá)的siRNA;所述 的siRNA的正義鏈序列為SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一 個所示的序列。
5. -種治療黑色素瘤的藥物，其特征在于：所述的藥物的活性成分為：通過RNA干擾抑 制人黑色素瘤RNFll基因表達(dá)的siRNA及其載體，所述的siRNA的正義鏈序列為SEQNO. 1、 SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一個所示的序列。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制人黑色素瘤RNF11基因表達(dá)的siRNA，所述的siRNA為小雙鏈RNA，其正義鏈序列為SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一個所示的序列，本發(fā)明還公開該siRNA載體，該抑制人黑色素瘤RNF11基因表達(dá)的siRNA及其載體用于抑制黑色素瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移的用途。本發(fā)明siRNA及其載體適于制備治療黑色素瘤的藥物。
【IPC分類】C12N15-113, A61K48-00, A61K31-7088, A61P35-04
【公開號】CN104726456
【申請?zhí)枴緾N201510111302
【發(fā)明人】王磊, 楊海杰, 高珊珊, 王勉, 程斌峰, 馮志偉
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月15日