一種重組腺病毒Ad-PTN-Fc的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組腺病毒Ad-PTN-Fc。
【背景技術(shù)】
[0002] 多效生長(zhǎng)因子（pleiotrophin，PTN指蛋白，Ptn指基因）是一種可同肝素結(jié)合的分 泌性的生長(zhǎng)/分化因子，具有刺激細(xì)胞粘附、迀移、存活、生長(zhǎng)和分化等功能，最早是在1989 年由華盛頓醫(yī)學(xué)中心發(fā)現(xiàn)，其蛋白分子量大小約為17kD，對(duì)肝素有很高的親和性。
[0003] Ptn基因位于染色的提7q33_q34區(qū)域，長(zhǎng)度大于100kb，由168個(gè)氨基酸組成，主 要包括一個(gè)與分泌有關(guān)的信號(hào)序列，其中賴氨酸比例很大，約為21 %。在哺乳動(dòng)物，如牛， 鼠，人中，PTN的蛋白序列高度保守。PTN蛋白主要表達(dá)與發(fā)育的胚胎期，在健康的成年組織 中則主要存在于大腦中，其他組織較為罕見。除此之外，在子宮，睪丸Leydig細(xì)胞中也能夠 檢測(cè)到一定水平的表達(dá)。PTN蛋白具有兩個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)域，通過一折疊的linker連接，而 每個(gè)β折疊又含有3個(gè)反向平行的β鏈。在蛋白的兩段，分布有大量的賴氨酸，形成于肝 素結(jié)合的結(jié)構(gòu)，當(dāng)結(jié)合發(fā)生時(shí)，蛋白構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變。有研宄表明這種結(jié)構(gòu)域可以和細(xì)胞外 基質(zhì)的TSR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而接到細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用。由于PTN蛋白的序列高度 保守，因此其在細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和發(fā)育過程中有十分重要的作用。目前的研宄證實(shí)，PTN蛋 白對(duì)于血管生成，神經(jīng)突出生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞迀移和細(xì)胞有絲分裂方面都有促進(jìn)作用。
[0004] 2010年，美國(guó)杜克大學(xué)的細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室通過基因芯片篩選的方法發(fā)現(xiàn)PTN蛋白 在造血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增中有重要的促進(jìn)作用。他們是通過基因芯片篩選的方法篩選不同基 質(zhì)細(xì)胞中蛋白表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)在人腦內(nèi)皮細(xì)胞中，PTN的表達(dá)水平比其他細(xì)胞高很多，相 比其他非腦內(nèi)皮細(xì)胞多出25倍之多。接下來，他們利用骨髓分離的造血干細(xì)胞對(duì)PTN在造 血干細(xì)胞的擴(kuò)增中的作用進(jìn)行了深入的研宄。通過向造血干/祖細(xì)胞（HSPC)的培養(yǎng)體系 中加入PTN蛋白，能極大的提高HSPC的擴(kuò)增倍數(shù)。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于解決HSPC在現(xiàn)有的研宄 水平下的擴(kuò)增難的問題具有非常深遠(yuǎn)的意義。
[0005] 然而，現(xiàn)有促進(jìn)HSPC擴(kuò)增的方法，均是在培養(yǎng)體系中直接加入PTN蛋白，由于蛋白 在培養(yǎng)環(huán)境下半衰期短，促進(jìn)HSPC擴(kuò)增效果難以持續(xù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可以表達(dá)PTN的重組腺病毒及轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞，用于培養(yǎng)HSPC。
[0007] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒，它包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。其中，所 述重組病毒是重組腺病毒。其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明提供了一種包含轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，其中，轉(zhuǎn)入的基因是前述的重組病毒。
[0010] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞是包含前述重組病毒的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明還提供了前述細(xì)胞在制備造血干/祖細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞中的用途。
[0013] 滋養(yǎng)層細(xì)胞，也叫飼養(yǎng)層細(xì)胞，指可以通過分泌蛋白或者接觸促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)， 增殖的細(xì)胞層。
[0014] 本發(fā)明制備得到了重組腺病毒Ad-PTN-Fc，將其感染間充質(zhì)干細(xì)胞后，間充質(zhì)干細(xì) 胞可以有效表達(dá)PTN蛋白，將感染了重組腺病毒Ad-PTN-Fc的間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì) 胞，可以有效提高造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增效率，應(yīng)用前景良好。
[0015] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0016] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0017] 圖1本發(fā)明重組腺病毒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018] 圖2本發(fā)明腺病毒感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后48小時(shí)，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；
[0019] 圖3本發(fā)明腺病毒載體感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞與CD34+分選的臍帶血造血干細(xì)胞 共培養(yǎng)擴(kuò)增示意圖；
[0020] 圖4本發(fā)明腺病毒載體感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞與CD34+分選的臍帶血造血干細(xì)胞 共培養(yǎng)擴(kuò)增獲得的細(xì)胞集落形成能力檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1重組腺病毒的制備
[0022] -、重組腺病毒的制備
[0023] 1.重組腺病毒質(zhì)粒Ad-PTN-Fc的構(gòu)建
[0024] a.首先查找PTN蛋白序列，在不改變氨基酸序列的情況下對(duì)其核酸序列進(jìn)行 優(yōu)化，并按照優(yōu)化的序列通過基因公司合成PTN-Fc序列（SEQ ID NO. 1)，再進(jìn)一步合成 pShuttle-PTN-Fc 載體。
[0025] PTN-Fc 序列（SEQ ID NO. 1):
[0026] CCACCATGCAGGCACAGCAGTACCAGCAGCAGCGGAGGAAGTTCGCCGCTGCATTTCTGGCCTTCATCT TTATTCTGGCCGCTGTGGACACCGCAGAGGCAGGCAAGAAAGAGAAGCCAGAAAAGAAAGTCAAGAAAAGCGACTGC GGGGAATGGCAGTGGAGCGTGTGCGTCCCAACTTCCGGCGACTGTGGACTGGGAACCAGAGAGGGGACCCGCACAGG TGCTGAATGTAAACAGACCATGAAGACACAGCGGTGCAAAATCCCTTGTAACTGGAAGAAACAGTTCGGCGCCGAGT GCAAGTATCAGTTTCAGGCTTGGGGAGAATGTGACCTGAACACAGCTCTGAAAACTCGAACCGGGTCTCTGAAGAGG GCTCTGCACAATGCAGAGTGCCAGAAGACAGTGACTATTTCTAAACCCTGTGGCAAGCTGACTAAACCCAAGCCTCA GGCAGAGAGTAAGAAAAAGAAAAAGGAGGGAAAAAAGCAGGAAAAGATGCTGGATACAGGTAAGTGGATCCGGAGGG AGGGTHTCTGCTGGAAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAA GGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTT TTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTCGGCTC AGACCTGCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCT CAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCT AGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGG GAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCG GGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCGTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAG CACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTGATGGTTCTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGG CATGAGGGAGGCA
[0027] b. PmeI酶切線性化pShuttle-PTN-Fc載體，用乙醇沉淀法回收酶切產(chǎn)物。將酶切 產(chǎn)物加入到含有Adeasy的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，在200 Ω，2500v，2. 5uF的條件下進(jìn)行電 轉(zhuǎn)重組，用Iml LB培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)電轉(zhuǎn)產(chǎn)物1小時(shí)，接種卡那霉素培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。過 夜培養(yǎng)的培養(yǎng)板上挑取陽性克隆，在37°C條件下卡那霉素抗性LB中培養(yǎng)過夜，用小提試劑 盒提取質(zhì)粒DNA，通過PacI酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，確定陽性克隆。
[0028] 2.重組腺病毒的包裝
[0029] a.將步驟1中獲得的Ad-PTN-Fc載體用PacI進(jìn)行酶切，并用乙醇沉淀法進(jìn)行回 收，產(chǎn)物DNA用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染到6孔板的293細(xì)胞中。
[0030] b.觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)，在14天左右出現(xiàn)明顯病毒噬癍，收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞， 反復(fù)凍融3次進(jìn)行裂解釋放病毒。裂解上清按照不同滴度加到293細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，兩 天后出現(xiàn)細(xì)胞明顯病變，重復(fù)凍融裂解，并以此類推擴(kuò)增病毒。
[0031] 3.重組腺病毒的純化
[0032] 純化溶液：
[0033] a.氯化銫密度梯度溶液的配置：稱取120gCsCl，將其溶液IXPBS溶液中，并用 IXPBS定溶至170ml，于超凈臺(tái)用0. 22 μ m無菌濾器過濾除菌，此時(shí)配置的CsCl融合的密 度為I. 5g/ml，定為A液；
[0034] b.取A液60ml，加入24ml無菌的I X PBS，配置得到溶液B ;
[0035] c.取A液44ml，加入36ml無菌的I X PBS，配置得到溶液C ;
[0036] d.將Iml吸管、5ml吸管、止血鉗、鑷子、兩瓶無菌水、兩個(gè)鋁制飯盒進(jìn)行高壓滅 菌；
[0037] e.將離心管、離心套管用75%的乙醇浸泡8~10h，于超凈臺(tái)取出后，用滅菌的無 菌水沖洗，直至離心管不掛壁，將其扣于滅菌鋁制飯盒中（地下鋪有紗布）；然后于超凈臺(tái) 紫外照射過夜；
[0038] f. IX PBS配置：用蒸餾水稀釋10 X PBS，用0.22 μ m濾膜過濾除去雜質(zhì)，然后高壓 滅菌；共配置20L ;
[0039] g.將收集的病毒液反復(fù)凍溶三次，并于3000rpmX4°C離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至 一 50ml離心管中，于-70°C保存待用；
[0040] 純化過程：
[0041] 將病毒液從-70°C取出后，融化待用；
[0042] 氯化銫密度加樣：取6個(gè)離心管，先向每管中加入2. 5ml的B液，然后用Iml的吸 管吸取0. 5ml的A液，將其加至離心管底部；最后用Iml的吸管往B液上緩慢加入C液（速 度一定要慢，不能破壞界面），總共加入2. 5ml ;
[0043] 病毒的加樣：往C液上方緩慢加入病毒液，加至距離管口約0. 3cm ;
[0044] 將離心管放入離心套管中，用天平進(jìn)行平衡，擰緊離心套管的蓋子后，于 4°C X 35000rpmX I. 5h 離心；
[0045] 將離心的病毒條帶用吸管吸取置于一新的離心管中（每三個(gè)管吸到一個(gè)新的離 心管中），向離心管中補(bǔ)加 B液和A液至管口 Icm左右，混勻；
[0046] 補(bǔ)加 C液0· 5ml左右；
[0047] 于 4°C X35000rpmX4. 5h 離心；
[0048] 用Iml注射器將病毒條帶吸出后，用I XPBS進(jìn)行適量稀釋；
[0049] 將其轉(zhuǎn)移到3~12ml的透析袋中；
[0050] 將其至于2L的IXPBS于4°C進(jìn)行透析：分別間隔0. 5h，lh，Ih和2h進(jìn)行PBS的 更換，最后過夜透析；
[0051] 病毒收集：
[0052] 將透析袋從透析液中取出，即得本發(fā)明重組腺病毒pAdeasy-PTN-FC，其結(jié)構(gòu)如圖 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0053] 重組腺病毒pAdeasy-PTN-FC的核苷酸序列（SEQ ID NO. 2):
[0054] CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGT GGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACAT GTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTT TTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGA AGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCA TAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCC CATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTAT TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGG TAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAG TCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTT CCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAA CAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGA ACCGTCAGATCCGCTAGAGATCTGGTACCCCACCATGCAGGCACAGCAGTACCAGCAGCAGCGGAGGAAGTTCGCCG CTGCATTTCTGGCCTTCATCTTTATTCTGGCCGCTGTGGACACCGCAGAGGCAGGCAAGAAAGAGAAGCCAGAAAAG AAAGTCAAGAAAAGCGACTGCGGGGAATGGCAGTGGAGCGTGTGCGTCCCAACTTCCGGCGACTGTGGACTGGGAAC CAGAGAGGGGACCCGCACAGGTGCTGAATGTAAACAGACCATGAAGACACAGCGGTGCAAAATCCCTTGTAACTGGA AGAAACAGTTCGGCGCCGAGTGCAAG