一種預(yù)防仔豬病毒性腹瀉的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防仔豬病毒性腹瀉的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)是兩種主要的引起豬 腹瀉的病毒性傳染病，這兩種病原引起的腹瀉對(duì)2周齡內(nèi)新生仔豬危害尤為嚴(yán)重，可導(dǎo)致 感染仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐與脫水，死亡率高達(dá)1〇〇%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 2010年以后，我國(guó)許多養(yǎng)豬地區(qū)再度大面積發(fā)生仔豬腹瀉，其中豬流行性腹瀉和豬傳染性 胃腸炎是最主要的兩個(gè)病原。2013年以后在美國(guó)、日本也暴發(fā)仔豬病毒性腹瀉，目前這類疫 病幾乎遍布世界各養(yǎng)豬地區(qū)。PEDV和TGEV主要通過腸道感染致病，兩種病毒的感染靶器官 是小腸，病毒主要侵入小腸黏膜引起發(fā)病，腸道黏膜免疫對(duì)阻止病毒感染有重要的作用，因 此增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)豬的腸道特異性黏膜免疫對(duì)其防治具有重要意義。
[0003] 我國(guó)部分豬場(chǎng)采取了疫苗預(yù)防接種措施，但臨床實(shí)際防控效果并不理想。目前分 別針對(duì)TGEV和PEDV的傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗，尚未有同時(shí)針對(duì)TGEV和PEDV的有效口服 疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種同時(shí)包含豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃 腸炎病毒抗原的新的疫苗。
[0005] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列
[0006] PEDV Sl基因的核苷酸序列（SEQ ID NO :1):
[0007] ACCATGAGGTCTTTAATTTACTTCTGGTTGCTCTTACCAGTACTTCCAACACTCAGCCTACCACAAGAT GTCACTAGGTGCCAGTCTACTACTAACTTTAGGCGGTTCTTTTCAAAATTTAATGTTCAGGCACCTGCCGTCGTCGT TTTGGGTGGTTACCTACCTAGTATGAACTCTTCTAGCTGGTACTGTGGCACAGGCATTGAAACTGCTAGTGGCGTTC ATGGTATTTTTCTCAGCTACATCGATTCTGGTCAGGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCGTTTGATCCTAGT GGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCCACTAATGGTAACACTAATGCTATTGCACGACTGCGCATTTGCCAGTTTCC CGATAATAAAACATTGGGCCCTACTGTTAATGATGTTACAACAGGTCGTAACTGCCTATTCAACAAAGCCATTCCAG CTTATATGCGTGATGGAAAAGATATTGTTGTCGGCATAACATGGGATAATGATCGTGTCACTGTTTTTGCTGACAAG ATCTATCATTTTTATCTTAAAAATGATTGGTCCCGCGTTGCGACAAGATGTTACAATCGCAGAAGTTGTGCTATGCA ATATGTTTATACACCTACCTACTACATGCTTAATGTTACTAGTGCAGGTGAGGATGGCATTTATTATGAACCCTGTA CAGCTAATTGCACTGGTTACGCTGCCAATGTATTTGCCACTGATTCCAATGGCCATATACCAGAAGGTTTTAGTTTT AATAATTGGTTTCTTTTATCCAATGACTCCACTTTGTTGCATGGTAAAGTGGTTTCCAACCAACCCTTGTTGGTCAA TTGTCTTTTGGCCATTCCTAAGATTTATGGACTAGGCCAATTTTTCTCATTCAATCACACGATGGATGGCGTTTGTA ATGGAGCTGCTGTGGATCGTGCCCCAGAGGCTCTGAGGTTTAATATTAATGACACCTCCGTCATTCTTGCTGAAGGC TCAATTGTACTTCATACTGCTTTAGGAACAAATCTTTCTTTTGTTTGCAGTAATTCCTCAGATCCTCATTTAGCCAT CTTTGCCATACCTCTGGGTGCTACTGAAGTACCCTACTATTGCTTTCTTAAAGTGGATACTTACAACTCCACTGTTT ATAAATTCTTGGCTGTTTTACCTCCTACTGTCAGGGAAATTGTCATCACCAAGTATGGTGATGTTTATGTCAATGGG TTTGGCTATTTGCATCTCGGTTTGTTGGATGCTGTCACAATTAATTTCACTGGTCATGGCACTGACGATGACGTTTC AGGTTTCTGGACCATAGCATCGACTAATTTTGTTGATGCACTCATCGAGGTTCAAGGAACTTCCATTCAGCGTATTC TTTATTGTGATGATCCTGTTAGCCAACTCAAGTGTTCTCAGGTTGCTTTTGACCTTGACGATGGTTTTTACCCCATC TCTTCTAGAAACCTTCTGAGTCACGAACAGCCAATTTCTTTTGTTACTTTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGT TAATATTACTGTCTCTGCGGCTTTTGGTGGTCTTAGTAGTGCCAATCTCGTTGCATCTGACACTACTATCAATGGGT TTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTACACTGTTTTATAATGTTACAAACAGTTATGGTTATGTG TCTAAATCACAGGATAGTAATTGTCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGT TTCAACCAGCCTTTTGGCTGGTGCTTGTACCATAGATCTTTTTGGTTACCCTGCGTTCGGTAGTGGTGTTAAGTTGA CGTCCCTTTATTTTCAATTCACAAAAGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTATCACAGACGTT TCTTTTATGACTCTGGATGTGTGTACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATTATTACCCTTACAAA TTCTAGCATTTTGGCAGGTGTTTATTATACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCCTTTAAGAATGTCACTAGTGGTG CTGTTTATTCTGTCACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCAGGCTGCATATGTTAATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCT AGTTTGTCTAACTCCACTTTTAACAATACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGACGGCTCCAATTG TACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTATGTTCCATCTCAGTATG GCCAAGTCAAGATTGCACCCACGGTTACTGGGAATATTAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGT
[0008] TGEV S基因的核苷酸序列（SEQ ID NO :2):
[0009] ACCATGAAAAAACTATTTGTGGTTTTGGTCGTAATGCCATTGATTTATGGAGACAATTTTCCTTGTTCT AAATTGACTAATAGAACTATAGGCAACCATTGGAATCTCATTGAAACCTTCCTTCTAAACTATAGTAGTAGGTTACC ACCTAATTCAGATGTGGTGTTAGGTGATTATTTTCCTACTGTACAACCTTGGTTTAATTGCATTCGCAATGATAGTA ATGACCTTTATGTTACACTGGAAAATCTTAAAGCATTGTATTGGGATTATGCTACAGAAAATATCACTTGGAATCAC AGACAACGGTTAAACGTAGTCGTTAATGGATACCCATACTCCATCACAGTTACAACAACCCGCAATTTTAATTCTGC TGAAGGTGCTATTATATGCATTTGTAAGGGCTCACCACCTACTACCACCACAGAATCTAGTTTGACTTGCAATTGGG GTAGTGAGTGCAGGTTAAACCATAAGTTCCCTATATGTCCTTCTAATTCAGAGGCAAATTGTGGTAATATGCTGTAT GGCCTACAATGGTTTGCAGATGAGGTTGTTGCTTATTTACATGGTGCTAGTTACCGTATTAGTTTTGAAAATCAATG GTCTGGCACTGTCACACTTGGTGATATGCGTGCGACAACATTAGAAGTCGCTGGCACGCTTGTAGACCTTTGGTGGT TTAATCCTGTTTATGATGTCAGTTATTATAGAGTTAATAATAAAAATGGTACTACCGTAGTTTCCAATTGCACTGAT CAATGTGCTAGTTATGTGGCTAATGTTTTTACTACACAGCCAGGAGGTTTTATACCATCAGATTTTAGTTTTAATAA TTGGTTCCTTCTAACTAATAGCTCCACGTTGGTTAGTGGTAAATTAGTTACCAAACAGCCGTTATTAGTTAATTGCT TATGGCCAGTCCCTAGCTTTGAAGAAGCAGCTTYTACATTTTGTTTTGAGGGTGCTGGCTTTGATCAATGTAATGGT GCTGTTTTAAATAACACTGTAGACGTCATTAGGTTCAACCTTAATTTTACTACAAATGTACAATCAGGTAAGGGTGC CACAGTGTTTTCATTGAACACAACGGGTGGTGTCACTCTTGAAATTTCATGTTATTATGATACAGTGAGTGACTCGA GCTTTTTCAGTTACGGTGAAATTCCGTTCGGCGTAACTGATGGACCACGGTACTGTTACGTACTCTATAATGGCACA GCTCTTAAGTATTTAGGAACATTACCACCTAGTGTCAAGGAGATTGCTATTAGTAAGTGGGGCCATTTTTATATTAA TGGTTACAATTTCTTTAGCACATTTCCTATTGATTGTATATCTTTTAATTTGACCACTGGTGATAGTGACGTTTTCT GGACAATAGCTTATACATCGTACACTGAAGCATTAGTACAAGTTGAAAACACAGCTATTACAAAGGTGACGTATTGT AATAGTCACGTTAATAACATTAAATGCTCTCAACTTACTGCTAATTTGAATAATGGATTTTATCCTGTTTCTTCAAG TGAAGTTGGTCTTGTCAATAAGAGTGTTGTGTTACTACCTAGCTTTTACACACATACCATTGTTAACATAACTATTG ATCTTGGTATGAAGCGTAGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCAACATTAAGTAACATCACACTACCAATGCAGGAT AACAACACCGATGTGTACTGTATTCGTTCTGACCAATTTTCAGTTTATGTTCATTCTACTTGCAAAAGTTCTTTATG GGACAATATTTTTAAGCGAAACTGCACGGACGTTTTAGATGCCACAGCTGTTATAAAAACTGGTACTTGTCCTTTCT CATTTGATAAATTGAACAATTACTTAACTTTTAACAAGTTCTGTTTGTCGTTGAGTCCTGTTGGTTAA
[0010] 本發(fā)明重組載體，包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
[0011] 所述的重組載體是重組pVAXD。
[0012] 本發(fā)明重組菌，它包含前述的重組載體。所述的重組菌為重組沙門氏菌所述的重 組沙門氏菌為重組減毒沙門氏菌SL7207。
[0013] 本發(fā)明重組菌在制備預(yù)防豬病毒性腹瀉的藥物中的用途。所述藥物包含致免疫有 效量的重組菌。所述豬病毒性腹瀉是豬流行性腹瀉病毒和/或豬傳染性胃腸炎病毒引起的 豬病毒性腹瀉。
[0014] 本發(fā)明疫苗，它是由前述重組菌和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
[0015] 所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或防腐劑。
[0016] 所述佐劑為霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素 B單位。
[0017] 所述防腐劑為硫柳汞。
[0018] 本發(fā)明前述的疫苗在制備預(yù)防豬病毒性腹瀉的藥物中的用途。
[0019] 所述豬病毒性腹瀉是豬流行性腹瀉病毒和/或豬傳染性胃腸炎病毒引起的豬病 毒性腹瀉。
[0020] 所述的預(yù)防豬病毒性腹瀉的藥物是是口服制劑，通過口服的方式給藥。
[0021] 本發(fā)明制備得到了同時(shí)攜帶PEDV和TGEV S雙基因的重組減毒沙門氏菌 SL7207 (pVAXD-Sp/St)，其免疫后可以同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)PEDV和TGEV的特異性抗體，保護(hù)性好， 將其制成疫苗口服免疫后，可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖，刺激機(jī)體產(chǎn)生豬傳染性胃腸炎病毒特異 性抗體以及γ -干擾素、IL-4等細(xì)胞因子，保護(hù)性強(qiáng)，并且穩(wěn)定好，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
[0022] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0023] 圖IPEDV Sl基因與TGEV S基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) MarkertO ;1. PEDV Sl 基因 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；2. TGEV S 基因 5'端 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0024] 圖2pMD19-T-St以及pMD19-T-Sp的酶切鑒定。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)MarkertO ; 1.重組質(zhì)粒Hind III/Kpnl雙酶切鑒定；2.重組質(zhì)粒EcoR I/Not I雙酶切鑒定；
[0025] 圖3pVAXD-Sp的酶切鑒定。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Markerm ;3-4.重組質(zhì)粒EcoR I/Not I雙酶切鑒定；
[0026] 圖4pVAXD-TS的酶切鑒定。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Markerm ;1-2.重組質(zhì)粒Hind III/Kpnl雙酶切鑒定；
[0027] 圖5pVAXD-Sp/St的酶切鑒定。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marke