一種來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的l-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷 氨酸氧化酶基因及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] L-谷氨酸氧化酶（LGOX)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)為輔基的黃素蛋白 酶類，能專一地催化谷氨酸氧化成α -酮戊二酸、氨和過氧化氫，通過過氧化氫含量的變化 可以方便地測定谷氨酸的含量，利用L-谷氨酸氧化酶研制出谷氨酸檢測試劑盒和生物傳 感器，在食品工業(yè)和臨床生化檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用（李玲等.L-谷氨酸氧化酶的分離 純化及酶學(xué)性質(zhì)的研宄.中國釀造.2012, 31(1) :140-143)。
[0003] 1983 年，Kusakabe 等從一株鏈霉菌 X-119-6 (Streptomyces sp. X-119-6)菌株 中分離出底物特異性的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物的Km值僅為0. 2mM，該酶 耐熱性較強(qiáng)，除催化L-谷氨酸氧化外，僅對L-天冬氨酸有微弱的催化作用（Kusakabe H et al. Purification and purification of a new enzyme，1-glutamate oxidase，from Streptomycessp. X-119-6grown on wheat bran. Agric Biol Chem. 1983,47 :1323-1328)， 2006年日本Yamasa公司構(gòu)建了鏈霉菌X-119-6基因組文庫，通過探針篩選獲得了 LGOX基 因，該基因長2103bp，編碼701個氨基酸，含有14個信號肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、 γ三個亞基組成，一般組成二聚體形式，分子量大約為140KDa。他們構(gòu)建大腸桿菌強(qiáng)啟動 子調(diào)控LGOX基因表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了 LGOX前體蛋白在大腸桿菌的高效 表達(dá)，表達(dá)的前體蛋白經(jīng)過內(nèi)切蛋白酶處理后可以變成活性蛋白（US patent7109008)。目 前該產(chǎn)品轉(zhuǎn)由Kikkoman公司生產(chǎn)并壟斷了市場。
[0004] 由于LGOX生產(chǎn)被國外企業(yè)控制，我國在上述領(lǐng)域研宄相對滯后，而至今所篩選到 的L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力大多很低，即使經(jīng)過誘變，產(chǎn)酶能力也不高，因此獲 得新型LGOX基因并實(shí)現(xiàn)基因工程化生產(chǎn)成為解決該酶來源的根本途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧 化酶基因及其制備方法和應(yīng)用，利用基因合成法制備淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌L-谷氨酸氧化酶 基因，并對該基因進(jìn)行表達(dá)和酶的底物譜分析，以證明其能特異性催化L-谷氨酸，具有作 為L-谷氨酸含量檢測用酶的前景。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 所述的來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No. 2。
[0008] 所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的獲取方法如下：
[0009] 利用含50ppm重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基（高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L， KN03lg/L，K2HPO4O. 5g/L，MgSO4 · 7Η200· 5g/L，NaClO. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· Olg/L，瓊脂 20g/L， pH = 7. 4)，從土壤微生物中篩選產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的菌株，菌株在顯色液（0.1 M磷酸鹽緩 沖液（PH6. 5)，0. 07 %的4-氨基安替吡啉，0. 8 %的L-谷氨酸，0. 1 %的苯酚，2000U/L的辣 根過氧化物酶）中顯紅色即為產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶。
[0010] 將篩選得到的菌落提取總DNA，根據(jù)L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列設(shè)計引物
[0011] Primer A :5' -AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3' 和 Primer B :
[0012] 5'-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3'為擴(kuò)增引物，以總 DNA 為模板，獲得一段 984bp 的PCR片段。以此序列為基礎(chǔ)，采用Genome Walking Kit試劑盒（大連寶生物公司）獲取 其兩側(cè)的未知序列，查找完整的開放閱讀框，從而獲得該L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。
[0013] 所述的堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通過化 學(xué)合成方法得到。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進(jìn)行全基因的合成（PTDS) (Nucleic Acids Research,2004, 32 ：e98)〇
[0014] 具體合成方法包括以下步驟：
[0015] 引物設(shè)計：設(shè)計長度大概為60bp左右的覆蓋整個L-谷氨酸氧化酶基因的寡核苷 酸的序列49個，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復(fù)。
[0016] PCR擴(kuò)增：利用PCR進(jìn)行L-谷氨酸氧化酶基因擴(kuò)增。以SLG1-SLG12 ;SLG13-SLG24 ; SLG25-SLG36 ;SLG37-SLG48 為引物，利用 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增 SLG1、SLG2、SLG3、SLG4 片段，在 50 μ 1 反應(yīng)體系中，其中內(nèi)側(cè)引物 SLG2-SLG11、SLG14-SLG23、SLG26-SLG35、SLG38-SLG47 引 物的添加量為 2ng，外側(cè)引物 SLG1、SLG12、SLG13、SLG24、SLG25、SLG36、SLG37、SLG48 個引 物添加量為30ng(引物序列見實(shí)施例4)，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)熱lmm;94°C，30S，50°C，30s， 72°C，lmin。共25個循環(huán)。擴(kuò)增片斷通過瓊脂糖凝膠回收，然后作為模版進(jìn)行拼接，擴(kuò)增小 片段SLG1、SLG2、SLG3、SLG4各1 μ g，以SLGl和SLG49為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為： 94°〇預(yù)熱111^11;94°〇，3〇8,50°〇，3〇8,72°〇，31^11。共25個循環(huán)。轉(zhuǎn)化屮0?結(jié)束后，用1% 瓊脂糖膠回收片段，取10 μ 1直接與T/A克隆載體相連（大連寶生物公司）。4°C連接過夜， 在DH5a感受態(tài)中高效轉(zhuǎn)化，獲得長度為1974bp的SEQ ID No. 1序列的陽性克隆，即為本發(fā) 明的L-谷氨酸氧化酶基因，經(jīng)序列測定，其核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0017] 將上述獲得的陽性克隆利用BamH I和Sac I進(jìn)行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將 該基因與載體pET-28a (NEB公司）4°C連接2小時，得到重組質(zhì)粒pET-pGOX，并將其轉(zhuǎn)化大 腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司），將菌液涂布于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB培 養(yǎng)基（15g/L瓊脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，磷酸緩沖液pH = 7.0)， 37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵 母提取物，l〇g/L NaCl，磷酸緩沖液pH = 7. 0)中，37°C搖床直到菌液的濃度達(dá)到0D_為 0. 6時加入終濃度為0. 5mM的IPTG，25°C誘導(dǎo)12h。9000rpm離心去上清，收集濕細(xì)胞。取 濕細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，再懸浮于PH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸鈉緩沖液中（Ig濕細(xì)胞 /IOml緩沖液）得懸浮液，用超聲波處理懸浮液（功率為400W，超聲4s，間歇6s，重復(fù)99 輪），9000rpm離心取上清，即得粗酶液。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司）對其進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，獲得L-谷氨酸氧化酶前體蛋白，然后加入千分 之一當(dāng)量的Factor Xa蛋白酶（New England Biolabs公司）在4°C下處理6h，即得本發(fā)明 的具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明從土壤中篩選獲得一株產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，并通過培養(yǎng)、提取總DNA和PCR擴(kuò)增后，得到了如SEQ ID No.l所示的 L-谷氨酸氧化酶基因。該L-谷氨酸氧化酶底物專一性很強(qiáng)，能特異性地催化L-谷氨酸，可 適用于L-谷氨酸含量檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶的SDS-PAGE電泳圖，其中1為用FactorXa蛋白 酶處理過后的L-谷氨酸氧化酶蛋白，含亞基α、β、γ，2代表用HisTrap HP試劑盒純化的 在大腸桿菌BL21 (DE3)過量表達(dá)的L-谷氨酸氧化酶前體蛋白，3為蛋白分子量MARKER。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的 技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的 精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0022] 本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich)公司。
[0023] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書【J.薩 姆布魯克、E. F弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學(xué)出版社】。
[0024] 實(shí)施例1菌種分離
[0025] 稱取土壤樣品lg，加入0· 9 % (w/v)氯化鈉溶液Iml，5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000 轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液lml，5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勾，冰上 IOmin靜置，吸取100 μ L溶液涂布于含有50ppm重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng) 4天。根據(jù)菌落形態(tài)和大小挑取菌落分別對應(yīng)地接入對照與顯色兩種平皿中（平皿中均為 高氏一號培養(yǎng)基），30°C下培養(yǎng)3天，取顯色平皿，將顯色液浸過的濾紙置于其菌落上，標(biāo)記 顯色快、紅色深的菌落在對照平皿上對應(yīng)菌落，挑取該菌落在高氏一號培養(yǎng)基上劃線分離， 30°C下培養(yǎng)3天，挑取單菌落保藏備用。
[0026] 實(shí)施例2總DNA提取及菌種鑒定
[0027] 將分離獲得的菌株接種于20mL液體培養(yǎng)基（酵母粉3g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖 l〇g/L，可溶