包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂質(zhì)，和用于產(chǎn)生提取的植物脂質(zhì) 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ω-3長鏈多元不飽和脂肪酸（LC-PUFA)現(xiàn)在被廣泛公認為是用于人和動物健康 的重要化合物。這些脂肪酸可從膳食來源中獲得或者可通過轉(zhuǎn)化亞油酸（LA，18 :2ω6)或 α-亞麻酸（ALA，18 :3ω 3)脂肪酸來獲得，這兩種脂肪酸均被認為是人膳食中的必需脂肪 酸。雖然人和很多其它脊椎動物能夠?qū)闹参飦碓传@得的LA或ALA轉(zhuǎn)化為C22,但他們以 極低的速率進行此轉(zhuǎn)化。此外，最現(xiàn)代的社會具有不平衡的膳食，其中至少90%多元不飽 和脂肪酸（PUFA)為ω6脂肪酸，而不是被認為理想的4 : 1比率或更少的ω6 :ω3脂肪 酸（Trautwein，2001)。人的LC-PUFA如二十碳五烯酸（ΕΡΑ，20 :5ω3)和二十二碳六烯酸 φΗΑ，22:6ω3)的直接膳食來源大部分來自魚或魚油。因此，健康專業(yè)人員推薦在人膳食 中常規(guī)地包括含有顯著水平的LC-PUFA的魚。逐漸地，魚來源的LC-PUFA油并入例如食物 產(chǎn)品和嬰兒配方中。然而，由于全球和國家漁業(yè)的下降，需要這些有利的增強健康的油的替 代來源。
[0003] 與動物相反，顯花植物缺乏合成具有長于18個碳的鏈長度的多元不飽和脂肪酸 的能力。具體地說，農(nóng)作物和園藝植物連同其它被子植物不具有合成源于ALA的較長鏈ω3 脂肪酸如ΕΡΑ、二十二碳五烯酸（DPA，22 :5ω 3)和DHA所需要的酶。因此，植物生物技術(shù)中 的重要目標為對產(chǎn)生大量LC-PUFA的農(nóng)作物植物進行工程化，從而提供這些化合物的替 代來源。
[0004] LC-PUFA牛物合成路徑
[0005] LC-PUFA在有機體如微藻、苔蘚和真菌中的生物合成通常作為一系列氧依賴性去 飽和和延伸反應(yīng)（圖1)出現(xiàn)。在這些有機體中產(chǎn)生EPA的最常見路徑包括Λ 6-去飽和、 Λ 6-延伸和Λ 5-去飽和（稱為Λ 6-去飽和路徑），而較不常見的路徑使用Λ 9-延伸、 Δ 8-去飽和和Λ 5-去飽和（稱為Λ 9-去飽和路徑）。這些連續(xù)的去飽和反應(yīng)和延伸反應(yīng) 可以ω6脂肪酸底物L(fēng)A(如圖1的左上部分（ω6)示意性示出的）或者ω 3底物ALA開 始，直到EPA(如圖1的右下部分（ω 3)示出的）。如果對ω6底物L(fēng)A進行初始Λ 6-去飽 和，三種酶的系列的LC-PUFA產(chǎn)物將為ω 6脂肪酸ARA。LC-PUFA合成有機體可使用如圖1 的Λ 17-去飽和酶步驟所示的ω 3-去飽和酶將ω 6脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω 3脂肪酸，以用于將花 生四烯酸（ARA，20:4c〇6)轉(zhuǎn)化為ΕΡΑ。ω3-去飽和酶家族的一些成員可作用于范圍為LA 至ARA的多種底物。植物ω 3-去飽和酶常明確催化LA至ALA的Λ 15-去飽和，而真菌和 酵母ω 3-去飽和酶對于ARA Λ 17-去飽和為EPA可為特異的（Pereira等，2004a ;Zank等， 2005)。一些報道表明可存在非特異性ω 3-去飽和酶，其可將各種各樣的ω 6底物轉(zhuǎn)化為 其對應(yīng)ω 3產(chǎn)物（Zhang等，2008)。
[0006] 在這些有機體中，通過EPA的Λ 5-延伸來產(chǎn)生DPA，然后通過Λ 4-去飽和來產(chǎn)生 DHA(圖I)，從而進行EPA至DHA的轉(zhuǎn)化。與此相反，哺乳動物使用所謂的"Sprecher"路 徑，所述路徑通過獨立于Λ 4-去飽和酶的三個獨立反應(yīng)將DPA轉(zhuǎn)化為DHA (Sprecher等， 1995)。
[0007] 通?？梢娪谥参?、苔蘚、微藻和低等動物如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans)中的前端去飽和酶主要接受與磷脂酰膽堿（PC)底物的sn-2位置酯化的脂肪酸 底物。這些去飽和酶因此被稱為?；?PC、脂質(zhì)連接的前端去飽和酶（Domergue等，2003)。 相比之下，高等動物前端去飽和酶通常接受酰基-CoA底物，其中脂肪酸底物連接至CoA， 而不是PC (Domergue等，2005)。已知一些微藻去飽和酶和一種植物去飽和酶使用與CoA酯 化的脂肪酸底物（表2)。
[0008] 每個PUFA延伸反應(yīng)由通過多組分蛋白質(zhì)復(fù)合物催化的四個步驟組成：首先，縮合 反應(yīng)引起來自丙二酰-CoA的2C單元添加至脂肪酸，從而引起β -酮酯酰中間體的形成。 然后，這通過NADPH還原，然后脫水以產(chǎn)生烯酰基中間體。最終對此中間體進行第二次還原 以產(chǎn)生延伸的脂肪酸。通常認為，這四個反應(yīng)的縮合步驟為底物特異性的，而其它步驟則不 是。實際上，這意味著只要引入對PUFA特異的縮合酶（通常稱為"延伸酶")，原生植物延伸 機構(gòu)就能夠延伸PUFA，盡管原生植物延伸機構(gòu)在延伸非原生PUFA底物中的效率可能較低。 在2007年，公布酵母延伸循環(huán)脫水酶的鑒別和表征（Denic和Weissman，2007)。
[0009] 植物、苔蘚和微藻的PUFA去飽和天然發(fā)生于主要在?；?PC庫中的脂肪酸底物， 而延伸發(fā)生于?；?CoA庫中的底物。通過磷脂酶（PLA)進行來自?；?PC分子的脂肪酸 至CoA載體的轉(zhuǎn)移，同時通過溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶（LPCAT)進行?；?CoA脂肪酸至 PC載體的轉(zhuǎn)移（圖18) (Singh等，2005)。
[0010] 工稈化地產(chǎn)牛LC-PUFA
[0011] 使用需氧Λ 6-去飽和/延伸路徑進行大部分LC-PUFA代謝工程化。在1996年 第一次報道使用來自集胞藻屬（Synechocystis)藻青菌的Δ 6-去飽和酶在煙草中生物合 成Y -亞麻酸（GLA，18 :3 ω 6) (Reddy和Thomas, 1996)。最近，已在農(nóng)作物如紅花（在種子 油中的 73% GLA ;Knauf 等，2006)和大豆（28% GLA ;Sato 等，2004)中產(chǎn)生 GLA。LC-PUFA 如EPA和DHA的產(chǎn)生由于所涉及的增加數(shù)目的去飽和和延伸步驟而涉及更復(fù)雜的工程 化。通過Qi等（2004)第一次報道陸生植物中的EPA產(chǎn)生，他們將編碼來自球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)的 Δ 9_ 延伸酶、來自眼蟲藻（Euglena gracilis)的 Δ 8_ 去飽和 酶以及來自高山被孢霉（Mortierella alpina)的Δ 5-去飽和酶的基因引入到擬南芥屬 中，從而產(chǎn)生高達3 % EPA。此工作隨后由Abbadi等（2004)進行，他們報道在使用編碼來 自小立碗蘚（Physcomitrella patens)的Δ 6_去飽和酶和Δ 6_延伸酶以及來自三角褐指 藻（Phaeodactylum tricornutum)的Δ 5-去飽和酶的基因的亞麻仁桿中產(chǎn)生高達0.8% EPA。
[0012] DHA產(chǎn)生的第一次報道是在WO 04/017467中，其中描述3% DHA在大豆胚而不是 種子中產(chǎn)生，這通過引入編碼異枝水霉（Saprolegnia diclina) Δ6-去飽和酶、高山被孢霉 Λ 6-去飽和酶、高山被孢霉Λ 5-去飽和酶、異枝水霉Λ 4-去飽和酶、異枝水霉Λ 17-去飽 和酶、高山被孢霉Λ 6-延伸酶以及路氏巴夫藻（Pavlova lutheri) Λ 5-延伸酶的基因來 實現(xiàn)。在也產(chǎn)生DHA的胚中的最大EPA水平為19. 6%，這指示EPA轉(zhuǎn)化為DHA的效率較差 (W0 2004/071467)。這個發(fā)現(xiàn)與由Robert等（2005)公布的發(fā)現(xiàn)類似，其中從EPA至DHA 的轉(zhuǎn)變較低，其中在使用斑馬魚Λ 5/6-去飽和酶、秀麗隱桿線蟲Λ 6-延伸酶以及鹽生巴 夫藻（Pavlova salina) Λ 5-延伸酶和Λ 4-去飽和酶的擬南芥屬中產(chǎn)生3% EPA和0.5% DHA。而且在2005年，Wu等公布在使用畸雌腐霉（Pythium irregulare)A6_去飽和酶、 破囊壺菌（Thraustochytrid) Δ5-去飽和酶、小立碗蘚Δ6-延伸酶、金蓋菊（Calendula officianalis) Δ 12-去飽和酶、破囊壺菌Δ 5_延伸酶、致病疫霉（Phytophthora infestans) Δ17-去飽和酶、虹轉(zhuǎn)（Oncorhyncus mykiss)LC_PUFA延伸酶、破囊壺菌 Δ4-去 飽和酶以及破囊壺菌LPCAT的印度芥菜（Brassica juncea)中產(chǎn)生25% ARA、15 % EPA和 1.5% DHA (Wu 等，2005)。在 Venegas-Caleron 等（2010)和 Ruiz-Lopez 等（2012)中提供產(chǎn) 生合成ω 3 LC-PUFA的油籽農(nóng)作物的努力的總結(jié)。如通過Ruiz-Lopez等（2012)指示的， 目前為止對于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生DHA所獲得的結(jié)果沒有接近魚油中所見的水平。
[0013] 因此，仍需要LC-PUFA在重組細胞中的更有效的產(chǎn)生，具體地為DHA在含油種子植 物的種子中的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明人已確定用于產(chǎn)生具有高水平DHA的脂質(zhì)的方法和植物。如PCT/ AU2013/000639中所描述的，本發(fā)明人先前已公開提取的植物脂質(zhì)以及用于產(chǎn)生此類脂質(zhì) 的植物和植物部分，在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中包含7%與20%之間的DHA。限定 20%的上限，因為此時這被認為是可在植物中產(chǎn)生的最大量的DHA。然而，本發(fā)明人意外地 發(fā)現(xiàn)在總脂肪酸含量中可獲得大于20%的DHA水平。
[0015] 因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生提取的植物脂質(zhì)的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0016] i)獲得植物部分，其脂質(zhì)包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸、棕櫚酸、 包括亞油酸（LA)的ω6脂肪酸、包括α-亞麻酸（ALA)和二十二碳六烯酸（DHA)的ω3脂 肪酸以及任選地十八碳四烯酸（SDA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十 碳四烯酸（ETA)中的一種或多種，其中DHA在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為 20. 1%與35%之間，其中棕櫚酸在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為2%與16%之 間，并且其中肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平小于1% ;以及
[0017] ii)從所述植物部分提取脂質(zhì)；
[0018] 其中DHA在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為20. 1%與35%之間。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生提取的植物脂質(zhì)的方法，其包括以下步 驟：
[0020] i)獲得包含脂質(zhì)的植物部分，所述脂質(zhì)包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含 油酸、棕櫚酸、包含亞油酸（LA)和Y-亞麻酸（GLA)的ω6脂肪酸、包含 α-亞麻酸（ALA)、 十八碳四烯酸（SDA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十二碳六烯酸（DHA)的ω3脂肪酸以及任 選二十碳五烯酸（EPA)和二十碳四烯酸（ETA)中的一種或多種，其中DHA在植物部分的可 提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為20. 1%與30%之間或者20. 1%與35%之間，優(yōu)選 為30%與35%之間；以及
[0021] ii)從所述植物部分提取脂質(zhì)；
[0022] 其中DHA在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為20. 1%與30%之間或者 20. 1%與35%之間，優(yōu)選地為30%與35%之間。
[0023] 獲得植物部分或重組細胞的步驟可包括從產(chǎn)生所述植物部分的植物中收獲所述 植物部分（優(yōu)選為種子）、從此類細胞的培養(yǎng)物中回收重組細胞或者通過從生產(chǎn)者或供應(yīng) 商購買或通過進口來獲得所述植物部分或重組細胞。所述方法可包括確定脂質(zhì)在植物部分 或重組細胞的樣品中的脂肪酸組成或者提取的脂質(zhì)的脂肪酸組成的步驟。
[0024] 在一個實施方案中，提取的脂質(zhì)具有以下特征中的一個或多個或所有：
[0025] i)棕櫚酸在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為2%與15%之間；
[0026] ii)肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為約0. 1%;
[0027] iii)油酸在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為1%與30%之間；
[0028] iv)亞油酸（LA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為4%與20%之 間；
[0029] V) α -亞麻酸（ALA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為4%與40% 之間；
[0030] Vi) γ -亞麻酸（GLA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為0. 05 %與 7%之間；
[0031] Vii)十八碳四烯酸（SDA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為 0· 05%與10%之間；
[0032] viii)二十碳四烯酸（ETA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平小于 6% ；
[0033] ix)二十碳三烯酸（ETrA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平小于 4% ；
[0034] X)所提取的植物脂質(zhì)在其脂肪酸含量中包含小于0. 1%的ω6-二十二碳五烯酸 (22 5 Δ 4,7,10,13,16)
[0035] xi)新ω6脂肪酸在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平小于10% ;
[0036] xii)總ω6脂肪酸：總ω3脂肪酸在所提取的植物脂質(zhì)的脂肪酸含量中的比率為 I. 0與3. 0之間或者0. 1與1之間；
[0037] xiii)新ω6脂肪酸：新ω 3脂肪酸在所提取的植物脂質(zhì)的脂肪酸含量中的比率 為I. 0與3. 0之間、0. 02與0. 1之間或者0. 1與1之間；
[0038] xiv)所提取的植物脂質(zhì)的脂肪酸組成是基于至少10 %的油酸至DHA的轉(zhuǎn)化效 率；
[0039] XV)所提取的植物脂質(zhì)的脂肪酸組成是基于至少15%的LA至DHA的轉(zhuǎn)化效率；
[0040] XVi)所提取的植物脂質(zhì)的脂肪酸組成是基于至少17%的ALA至DHA的轉(zhuǎn)化效率；
[0041] xvii)所提取的植物脂質(zhì)中的總脂肪酸具有小于I. 5% C20 :1 ;
[0042] xviii)所提取的植物脂質(zhì)的三酰甘油（TAG)含量為至少70% ;
[0043] xix)所提取的植物脂質(zhì)包含含有DHA的二酰甘油（DAG);
[0044] XX)所提取的植物脂質(zhì)包含小于10%游離（未酯化的）脂肪酸和/或磷脂，或者 基本上不包含它們；
[0045] xxi)以TAG形式酯化的至少70% DHA處于所述TAG的sn-Ι或sn-3位置；
[0046] xxii)在所提取的植物脂質(zhì)中最豐富的含有DHA的TAG種類為DHA/18 :3/18 : 3 (TAG 58 :12);以及
[0047] xxiii)所提取的tt物糙/mr三.-DHA TAG <TAG 66:⑶h
[0048] 在一個實施方案中，二十碳五烯酸（EPA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中 的水平為〇. 05%與10%之間。
[0049] 在另一個實施方案中，二十二碳五烯酸（DPA)在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含 量中的水平小于4%。
[0050] 在另一個實施方案中，DHA在所提取的植物脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為 20. 1%與30%之間。
[0051] 在另一個實施方案中，提取的脂質(zhì)具有以下性質(zhì)中的一個或多個或具有所有以下 特征
[0052] i)棕櫚酸在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為約2%與18%之間、約2% 與16%之間、約2%與15%之間或者約3%與約10%之間；
[0053] ii)肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為小于6%、小于 3%、小于2%、小于1%或約0. 1% ;
[0054] iii)油酸在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為約1%與約30%之間、約 3%與約30%之間、約6%與約30%之間、1 %與約20%之間、約30%與約60%之間、約45% 至約60%、約30%或者約15%與約30%之間；
[0055] iv)亞油酸（LA)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為約4%與約35%之 間、約4%與約20%之間、約4%與17%之間或者約5%與約10%之間；
[0056] V) α -亞麻酸（ALA)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為約4%與約40% 之間、約7%與約40%之間、約10%與約35%之間、約20%與約35%之間、約4%與16%之 間或者約2%與16%之間；
[0057] vi) Y-亞麻酸（GLA)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為小于4%、小 于約3 %、小于約2 %、小于約1 %、小于約0. 5 %、0. 05%與7%之間、0. 05 %與4%之間、 0. 05%與約3%之間或者0. 05%與約2%之間；
[0058] vii)十八碳四烯酸（SDA)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為小于約 10%、小于約8%、小于約7%、小于約6%、小于約4%、小于約3%、約0. 05%與約7%之間、 約0. 05 %與約6 %、約0. 05 %與約4%之間、約0. 05 %與約3 %之間、約0. 05 %與約10 %之 間或者0.05%與約2%之間；
[0059] viii)二十碳四烯酸（ETA)在所提取的脂質(zhì)的總脂肪酸含量中的水平為小于6%、