一種抗逆、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因旱稻的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗逆、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因旱稻的 培育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糧食安全和生態(tài)安全是我國農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展中的首要問題。水稻為保證我國糧食安 全做出了巨大貢獻。但水稻生產(chǎn)消耗了大量的淡水資源，作為重要的糧食作物，其用水量占 到農(nóng)業(yè)用水總量的很大一部分，因此我國很多地區(qū)缺水的現(xiàn)狀已成為影響水稻產(chǎn)量的重要 原因之一。我國大約有一億多畝鹽堿地，主要分布在東北、華北、西北等干旱和半干旱地區(qū) 以及長江以北的沿海地區(qū)。隨著我國人口的劇增及工業(yè)的高速發(fā)展，可耕地急劇下降，而不 合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生鹽漬化，特別是受側(cè)滲補給的低洼地，土壤鹽漬 化日益嚴重，且有逐年增加的趨勢，嚴重威脅著我國的水稻生產(chǎn)。除了干旱、鹽堿等非生物 脅迫外，稻田雜草因與水稻爭奪光、水、肥等資也成為影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因子。雜 草競爭干擾導致水稻減產(chǎn)15%以上。雜草籽粒摻雜，影響谷物品質(zhì)，有毒雜草還危害人類健 康。一些雜草是作物病蟲害的重要寄主，間接增加了田間殺蟲劑等化學物質(zhì)的投放。
[0003] 因此，抗逆和抗除草劑水稻新品種培育迫在眉睫。但是傳統(tǒng)育種周期長，選育過程 復雜，而且很難獲得兼具抗逆和抗除草劑的能力的新品種。為了克服鹽堿和干旱等非生物 逆境對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害，滿足世界和我國對抗旱、耐鹽水稻品種日益增長的需求，同時有效 地控制稻田雜草，降低勞動力需求，提高水稻增產(chǎn)潛力，本申請應用現(xiàn)代生物技術(shù)，克隆了 小立碗蘚中的抗逆基因8981基因，與抗除草劑基因 bar共同構(gòu)建表達載體后，通過農(nóng)桿菌 侵染法導入適于旱地種植的栽培稻即旱稻栽培種中，創(chuàng)制一批重要的轉(zhuǎn)基因新材料，為培 育抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種提供重要的基礎，該技術(shù)目前還未見有相關(guān)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種抗逆、抗除草劑的轉(zhuǎn) 基因旱稻的培育方法。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 一種抗逆、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因旱稻的培育方法，包括以下步驟：
[0007] 1)利用抗逆8981基因構(gòu)建重組表達載體pCAMBIA3301-Ubi-8981 ;
[0008] 2)將重組表達載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌，并利用農(nóng)桿菌菌液侵染目的旱稻的胚性愈傷組 織，利用共培養(yǎng)基培養(yǎng)；
[0009] 3)對共培養(yǎng)后的愈傷組織脫菌并恢復，轉(zhuǎn)移至含有草銨膦的篩選培養(yǎng)基中進行篩 選；
[0010] 4)將篩選的抗性愈傷組織經(jīng)預分化和分化培養(yǎng)，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到抗逆、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因旱稻。
[0011] 本發(fā)明所述的8981基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0012] 所述的重組表達載體的構(gòu)建方法為：用EcoR I和BamH I酶切Ubi-T載體，得到含 有Ubiquitin基因的片段；用BamH I和Pml I酶切8981-T載體，得到含有8981基因的片 段；將含有Ubiquitin和8981基因的片段依次插入到載體pCAMBIA3301的多克隆位點中， 得到所述重組表達載體命名為PCAMBIA3301-UM-8981。
[0013] 進一步的，所述的Ubi-T載體為：通過將Ubiquitin基因連接pG EM-T vector 得到，所述的 Ubiquitinp 基因 PCR 擴增引物為 5' -CGG AATTCCTGCAGTGCAGCGTGACC-3' 和 5' -CGGGATCC CTGCAG AAGTAACACCAAACAAC-3'，擴增出的 Ubiquitin 長度為 2. Okb。
[0014] 進一步的，所述的所述8981-T載體為：將8981基因連接pGEM-T vector得到， 所述的 8981 基因 PCR 擴增引物為 5' -GGATCC TC TTGTGTATATTGTGCGC-3' 和 5' -CACGTG TGCGGTGTCTTATT TACTAT-3'。
[0015] 本發(fā)明所述目的旱稻為鯤旱1號。
[0016] 所述的共培養(yǎng)基為：NB+2, 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+葡萄糖10g/L+AS20mg/L+凝膠 3. 2g/L，培養(yǎng)條件為：pH5. 2,25°C暗培養(yǎng)3天。
[0017] 所述的愈傷組織恢復培養(yǎng)基為：NB+特美汀500mg/L+麥芽糖30g/L+凝膠0. 58 %， pH6. 0,培養(yǎng)條件為：28°C暗培養(yǎng)7天。
[0018] 所述的篩選培養(yǎng)基為：NB+麥芽糖30g/L+特美汀300mg/L+草銨膦40mg/L+凝膠 3. 2g/L，pH6. 0, 28°C避光篩選三輪，40天。
[0019] 所述的預分化培養(yǎng)基為：NB+NAAlmg/L+6-BA 3mg/L+ABA3mg/L+ 麥芽糖 30mg/L+ 特 美汀300mg/L+草銨膦40mg/L+凝膠3. 2g/L，pH6. 0,培養(yǎng)條件為：28°C暗培養(yǎng)5天。
[0020] 所述的分化培養(yǎng)基為：NB+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+麥芽糖30g/L+植物凝膠3. 2g/L， ρΗ5· 8,培養(yǎng)條件為：28°C暗培養(yǎng)。
[0021] 所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+蔗糖30g/L+NAA0. 5mg/L+植物凝膠I. 6g/L，ρΗ5· 8 ; 培養(yǎng)條件為：28 °C下光照培養(yǎng)3-4周。
[0022] 本發(fā)明的有益效果為：將含有LEA家族8981基因重組表達載體導入目的旱稻中， 得到抗逆的轉(zhuǎn)基因旱稻，所述轉(zhuǎn)基因旱稻對干旱、鹽堿以及除草劑的抗性高于目的旱稻。實 驗證實，本發(fā)明的重組載體導入旱稻中，得到100個轉(zhuǎn)基因旱稻株系。對100個陽性株系的 T3代依次進行了 PCR、RT-PCR篩選鑒定以及抗逆實驗，得到對逆境及除草劑草銨膦具有良好 抗性的轉(zhuǎn)基因旱稻株系，在培育新的抗逆旱稻品種中有良好的應用前景。本發(fā)明方法也可 應用于其他植物新品種的培育中。
【附圖說明】
[0023] 圖1是表達載體pCAMBIA3301-Ubi-8981的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)簡圖；LB，T-DNA左邊 界；RB, T-DNA右邊界；CaMV 35S，煙草花葉病毒35S啟動子；Nos, Nos終止子；Ubi,玉米 Ubiquitin啟動子；Bar，抗除草劑基因（PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）；8981，LEA家族抗逆基因 8981 ；
[0024] 圖2是轉(zhuǎn)8981基因旱稻的PCR檢測結(jié)果；
[0025] 圖3是轉(zhuǎn)8981基因旱稻的RT-PCR檢測結(jié)果；
[0026] 圖4是15% PEG4000脅迫轉(zhuǎn)基因旱稻鑒定圖；A為正常生長至三葉期的旱稻，cl 為非轉(zhuǎn)基因旱稻，al、bl、dl、el為4個不同的轉(zhuǎn)基因旱稻株系；B為15% PEG4000脅迫7 天后旱稻生長狀況，c2為非轉(zhuǎn)基因旱稻，a2、b2、d2、e2為4個不同的轉(zhuǎn)基因旱稻株系；C為 復水7天后旱稻生長狀況，c3為非轉(zhuǎn)基因旱稻，a3、b3、d3、e3為4個不同的轉(zhuǎn)基因旱稻株 系；
[0027] 圖5是0. 75% NaCl處理5天轉(zhuǎn)基因旱稻萌發(fā)圖。A為非轉(zhuǎn)基因旱稻鯤旱1號；B 為轉(zhuǎn)8981基因旱稻鯤旱1號；
[0028] 圖6是0. 8mg/ml草銨膦噴灑三葉期轉(zhuǎn)基因旱稻鑒定結(jié)果圖；A為噴灑草銨膦前旱 稻生長情況，其中al為非轉(zhuǎn)基因旱稻，bl為轉(zhuǎn)基因旱稻；B為噴灑0. 8mg/ml草銨膦72h后 旱稻生長情況，其中a2為非轉(zhuǎn)基因旱稻，b2為轉(zhuǎn)基因旱稻；
[0029] 圖7是轉(zhuǎn)基因旱稻與非轉(zhuǎn)基因旱稻田間噴施500mg/L除草劑15天后效果；A、D、E 為轉(zhuǎn)8981基因旱稻不同株系，B、C為非轉(zhuǎn)基因旱稻。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0031] 實施例1重組載體的構(gòu)建
[0032] 1、8981基因的克隆
[0033] 以小立碗蘚cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接到pGEM-T vector上， 構(gòu)建出克隆載體8981-T。所用引物為：
[0034] 5' -GGATCC TCTTGTGTATATTGTGCGC-3' ；
[0035] 5' -CACGTG TGCGGTGTCTTATTTACTAT-3'，