斜體字體為下調(diào)代謝物。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017] 實(shí)施例1 一種寇氏隱甲藻的異養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海鹽25 g/ L。在所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基中，加入植物生長調(diào)節(jié)劑為吲哚乙酸（IAA)，濃度為2.5 mg/L。25 °C下培養(yǎng)72小時后，提取油脂，使用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定培養(yǎng)物DHA含量，同時從平行培養(yǎng)物中 提取細(xì)胞代謝物，利用LC-MS方法檢測分析胞內(nèi)代謝物的變化情況。
[0018] 實(shí)施例2 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為萘氧乙酸（ΒΝ0Α)， 濃度為4 mg/L。
[0019] 實(shí)施例3 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為氯苯甲酸，濃度為4 mg/L〇
[0020] 實(shí)施例4 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為水楊酸（SA)，濃度 為 I mg/L〇
[0021] 實(shí)施例5 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為脫落酸（ABA)，濃度 為 20 mg/L。
[0022] 實(shí)施例6 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為乙醇胺，濃度為2. 5 mM〇
[0023] 實(shí)施例7 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為水楊酸（SA)與乙醇 胺，濃度為水楊酸（SA) I mg/L，乙醇胺2. 5 mM。
[0024] 實(shí)施例8 和實(shí)施例1的情況基本上相同，只是其中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑為萘氧乙酸（BNOA)與 乙醇胺，濃度為萘氧乙酸（BNOA) 4 mg/L，乙醇胺2. 5 mM。
[0025] 具體實(shí)驗步驟：分別將0. 2克吲哚乙酸（ΙΑΑ)、0. 2克萘氧乙酸（ΒΝ0Α)、0. 2克氯苯 甲酸加入到IOmL二甲基亞砜中充分溶解，配成20 mg/mL的儲液，將0. 1克水楊酸（SA)加 入到10 mL水中充分溶解，配成10 mg/mL的儲液，將0. 025克脫落酸（ABA)加入到10 mL水 中充分溶解，配成2. 5 mg/mL的儲液，將0.006克乙醇胺加入到10 mL水中充分溶解，配成 10 mM的儲液，將所有儲液過濾除菌，即得到各種植物生長調(diào)節(jié)劑儲液。按照報導(dǎo)的培養(yǎng)基 方案，即葡萄糖9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海鹽25 g/L，配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入油脂積累促進(jìn) 劑，得到含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的促進(jìn)隱甲藻中DHA積累的培養(yǎng)基。分別接種處于旺盛 對數(shù)生長期的寇氏隱甲藻（coA/?ii)株系（藻株來自美國菌種保藏中心 ATCC30772)。將藻株分別接種到上述培養(yǎng)基后搖勻，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗。在250 mL搖瓶中裝入 100 mL上述培養(yǎng)基，以O(shè)D46tol=O. 1為初始接種量，同時設(shè)計只加相同體積的溶劑以及不做任 何處理的菌株作為對照試驗，每個處理3個重復(fù)。然后利用天津市歐諾儀器儀表有限公司 HNY-202B搖床進(jìn)行單因子實(shí)驗，培養(yǎng)溫度為25 °C，隨機(jī)排放各瓶在搖床內(nèi)的位置，減少處 理誤差。
[0026] 在細(xì)胞生長到72 h時，收集一定量細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)敘述的油脂抽提以及氣質(zhì)聯(lián)用 儀（GC-MS/MS)的方法測定樣品中二十二碳六烯酸（DHA)的含量。在實(shí)驗過程中，不同種 類的植物生長調(diào)節(jié)劑對異養(yǎng)微生物的作用存在一定差異，但在一定濃度下能促進(jìn)細(xì)胞的 二十二碳六烯酸（DHA)的積累。
[0027] 同時，收集一定量細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)敘述的代謝物提取方法以及LC-MS的方法測定 各樣品中代謝物的含量。
[0028] 最后通過論證，與空白對照組相比，添加不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞的 二十二碳六烯酸（DHA)含量有明顯提高，DHA積累情況比沒有使用植物生長調(diào)節(jié)劑的對照 提高5%-19%，促DHA積累效果明顯(表1);通過對細(xì)胞代謝物的分析，與對照組相比，DHA積 累增加的細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)均上調(diào)，磷酸戊糖途徑下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)與DHA積累 相關(guān)的生物標(biāo)志物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1，6-二磷酸、磷酸二羥丙酮、 乙酰-輔酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸。
[0029] 表1相對于對照，添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑后，隱甲藻DHA積累情況
【主權(quán)項】
1. 多種化學(xué)促進(jìn)劑提高異養(yǎng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸（DHA)的方法，其特征 是，以寇氏隱甲藻的異養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其中添加任一種化學(xué)促進(jìn)劑；所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基 的組成為：葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海鹽25g/L;所說的化學(xué)促進(jìn)劑也可稱為植物 生長調(diào)節(jié)劑，包括吲哚乙酸（IAA)、萘氧乙酸（BNOA)、氯苯甲酸、水楊酸（SA)、脫落酸（ABA)、 乙醇胺，這些化學(xué)促進(jìn)劑在所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為：剛哚乙酸（IAA) 2. 5mg/L，萘氧 乙酸0^(^)4 11^凡，氯苯甲酸4 11^凡，水楊酸（34)111^凡，脫落酸（41^)2〇11^凡，乙醇胺 2. 5mM;25 °C下培養(yǎng)72小時后，提取油脂，使用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定培養(yǎng)物DHA含量，同時從 平行培養(yǎng)物中提取細(xì)胞代謝物，利用代謝組學(xué)方法檢測分析胞內(nèi)代謝物的含量變化情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基中還可添加兩種組合的 植物生長調(diào)節(jié)劑，即萘氧乙酸（BNOA)與乙醇胺和水楊酸（SA)與乙醇胺兩種組合；所說的兩 種組合的植物生長調(diào)節(jié)劑在異養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為：萘氧乙酸（BNOA) 4mg/L，水楊酸（SA) Img/L，乙醇胺 2. 5mM。
【專利摘要】本發(fā)明多種化學(xué)促進(jìn)劑提高異養(yǎng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸（DHA）的方法，以寇氏隱甲藻的異養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其中添加任一種化學(xué)促進(jìn)劑；所說異養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖9 g/L,酵母浸粉2g/L,海鹽25g/L；所說化學(xué)促進(jìn)劑也可稱為植物生長調(diào)節(jié)劑，包括吲哚乙酸（IAA）、萘氧乙酸（BNOA）、氯苯甲酸、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、乙醇胺，這些化學(xué)促進(jìn)劑，在所說異養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為：吲哚乙酸（IAA）2.5mg/L，萘氧乙酸（BNOA）4mg/L，氯苯甲酸4mg/L，水楊酸（SA）1 mg/L，脫落酸（ABA）20 mg/L，乙醇胺2.5 mM；25oC下培養(yǎng)72小時后，提取油脂，使用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定培養(yǎng)物DHA含量，同時從平行培養(yǎng)物中提取細(xì)胞代謝物，利用代謝組學(xué)方法檢測分析胞內(nèi)代謝物的含量變化情況。
【IPC分類】C12R1-89, C12P7-64
【公開號】CN104726508
【申請?zhí)枴緾N201510055312
【發(fā)明人】張衛(wèi)文, 陳磊, 劉璐
【申請人】昆明藻能生物科技有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年2月3日