一種青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲microRNA的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲microRNA 的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血吸蟲病是一種由寄生在腸系膜門靜脈系統(tǒng)的裂體吸蟲引起的感染性疾病，是七 大被忽視的熱帶病之一，給熱帶和亞熱帶逾76個(gè)國(guó)家和地區(qū)帶來了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生學(xué)問 題。目前，中國(guó)約有24萬(wàn)人罹患血吸蟲病，因此，該病依然是中國(guó)亟待解決的一個(gè)重要公 共衛(wèi)生問題。從20世紀(jì)90年代開始，國(guó)內(nèi)開展了大量抗血吸蟲病的藥物篩選工作。我們 前期研宄發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠有效殺滅日本血吸蟲童蟲，具有很好的預(yù)防日本血吸蟲病的效 果。但是，青蒿琥酯抗日本血吸蟲的分子機(jī)制不甚清楚。
[0003] microRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其大 小約20-25個(gè)核苷酸。研宄表明microRNAs廣泛參與了血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，性別分化和維 持以及致病等生物學(xué)過程。MicroRNAs作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，能夠低調(diào)藥物作用相 關(guān)功能基因進(jìn)而影響藥物效用。這很大程度上推動(dòng)了藥物基因組學(xué)向藥物相關(guān)microRNAs 組學(xué)的快速轉(zhuǎn)變與發(fā)展。近年來，Solexa高通量測(cè)序技術(shù)已成為差異microRNAs表達(dá)譜鑒 定分析的有力工具，尤其在藥物相關(guān)microRNAs組的研宄領(lǐng)域。目前，尚無人開展青蒿琥醋 作用日本血吸蟲童蟲相關(guān)顯著性差異microRNAs的高通量鑒定研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種高通量篩選、鑒定青蒿琥酯作用日 本血吸蟲童蟲相關(guān)microRNAs的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲 microRNA的檢測(cè)方法，由以下步驟組成；
[0006] (1)動(dòng)物分組與尾蝴感染
[0007] 將清潔級(jí)小鼠分為青蒿琥酯處理組和對(duì)照組，每只小鼠采用腹部貼片法感染尾蝴 180~200條/只；
[0008] (2)藥物處理與蟲體總RNA抽提
[0009] 青蒿琥酯（Art)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %羧甲基纖維素鈉溶液，得到Art溶液；尾蝴感 染7天后給青蒿琥酯處理組的每只小鼠灌服Art溶液，藥物劑量為120mg/kg，對(duì)照組僅灌服 與Art溶液相同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%羧甲基纖維素鈉溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含 有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 005%肝素鈉的生理鹽水溶液經(jīng)肝門靜脈進(jìn)行灌注沖洗，得到兩組10日齡 的日本血吸蟲，PBS漂洗日本血吸蟲3次；將漂洗后的日本血吸蟲在-80 °C下冷凍保存后，用 Trizol試劑分別抽提兩組日本血吸蟲的總RNA。
[0010] (3)文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
[0011] 采用TruSeq Small RNA Sample Pr印試劑盒分別對(duì)步驟2提取的兩組日本血吸 蟲的總RNA，構(gòu)建青蒿琥酯處理組的DNA文庫(kù)與對(duì)照組的DNA文庫(kù)；針對(duì)以上兩個(gè)DNA文庫(kù)， 用Illumina Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，讀長(zhǎng)為單端50bp ;
[0012] (4)原始數(shù)據(jù)去冗余
[0013] 將步驟3測(cè)序得到的兩組測(cè)序結(jié)果，去除接頭序列、mRNA序列、RFam序列、重復(fù)序 列和非典型microRNA序列，保留18_26bp的核苷酸序列；
[0014] (5)參考miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)
[0015] 將步驟4得到的兩組18-26bp的核苷酸序列分別與miRBase 21.0日本血吸 蟲microRNAs的前體序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出兩組18-26bp的核苷酸序列中，與 microRNAs的前體序列匹配的microRNAs ;
[0016] (6)青蒿琥醋作用相關(guān)microRNA差異表達(dá)分析
[0017] 采用Fisher exact和Chi-squared 2x 2檢驗(yàn)方法比較步驟5中篩選出的匹配 的microRNAs在兩組18-26bp的核苷酸序列中的表達(dá)豐度，篩選出差異倍數(shù)>2或〈0. 5的 microRNAs，同時(shí)計(jì)算表達(dá)豐度的顯著性指數(shù)（p-Value)，進(jìn)一步篩選出pvalue〈0. 01的 microRNAs，即為顯著性差異microRNA。
[0018] 進(jìn)一步地，所述顯著性差異microRNA為：如SEQ ID NO. 1所示的sja-mir_2f-p5， 如SEQIDN0·2所示的sja-miR-125b，如SEQIDN0·3所示的sja-miR-3505，如SEQID N0·4所示的sja-miR-3504，如SEQIDN(λ5所示的sja-mir-3486-p3，如SEQIDN(λ6所示 的 sja-miR-3484-5p，以及如 SEQ ID NO. 7 所示的 sja-miR-2c-3p。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明將尾蝴感染的小鼠用青蒿琥酯藥物干預(yù)，利用 Solexa高通量深度測(cè)序技術(shù)，對(duì)青蒿琥酯藥物處理組和對(duì)照組樣本進(jìn)行混池測(cè)序分析，首 次高通量地研宄體內(nèi)藥物處理日本血吸蟲后相應(yīng)microRNAs的差異變化，篩選鑒定出藥物 作用相關(guān)顯著性差異microRNAs，為深入研宄microRNA在青蒿琥醋抗日本血吸蟲中的作用 機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為新藥的研發(fā)提供潛在藥物靶點(diǎn)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為18-26bp的短核苷酸序列的表達(dá)豐度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] -種青蒿琥醋作用日本血吸蟲童蟲相關(guān)microRNAs鑒定方法，有以下步驟：
[0022] 1)動(dòng)物分組與尾蝴感染
[0023] 將100只清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)分為75只青蒿琥酯藥物處理組（ART)和25只對(duì)照 組（C0N)。取陽(yáng)性釘螺在30-35°C恒溫箱孵育7d，清洗后放置于潔凈燒杯中，加入去氯離子 水，28°C恒濕恒溫箱光照下逸出尾蝴。兩組小鼠采用腹部貼片法感染尾蝴約200條/只。
[0024] 2)藥物處理與蟲體收集
[0025] 青蒿琥酯（Art)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %羧甲基纖維素鈉溶液，得到Art溶液；尾蝴感 染7天后給青蒿琥酯處理組的每只小鼠灌服Art溶液，藥物劑量為120mg/kg，對(duì)照組僅灌服 與Art溶液相同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%羧甲基纖維素鈉溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含 有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 005%肝素鈉的生理鹽水溶液經(jīng)肝門靜脈進(jìn)行灌注沖洗，得到兩組10日齡 的日本血吸蟲，PBS漂洗日本血吸蟲3次；將漂洗后的日本血吸蟲在-80°C下冷凍保存。
[0026] 3)文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
[0027] 使用Trizol試劑（Invitrogen, CA, USA)抽提青蒿琥醋處理組與對(duì)照組蟲體總 RNA。根據(jù) microRNA 的屬性，米用試劑盒 TruSeq Small RNA Sample Prep(Illumina, San Diego, USA)分別選取2ug總RNA構(gòu)建藥物處理組文庫(kù)（ART)和對(duì)照組文庫(kù)（CON)。利用 Illumina Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，讀長(zhǎng)為單端50bp。
[0028] 4)原始數(shù)據(jù)去冗余
[0029] 使用軟件 ACGT101_miR(LC Sciences, Houston, Texas, USA)對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行 去冗余。處理組的測(cè)序結(jié)果中，valid reads占72. 30%，3ADT和length filter占25. 41 %， Junk reads 占 0· 20%，重復(fù)序列占 0· 13%，rRNA 占 1. 29%，tRNA 占 0· 36%，snoRNA 占 0. 03%，snRNA占0. 06%，以及其他的Rfam RNA占0. 28% ;對(duì)照組的測(cè)序結(jié)果中，valid reads 占 87. 04%，3ADT 和 length filter 占 10. 77%，Junk reads 占 0· 27%，重復(fù)序列占 0· 12%，rRNA 占 1. 14%，tRNA 占 0· 37%，snoRNA 占 0· 03%，snRNA 占 0· 06%，以及其他的 Rf·amRNA占0.27%;通過數(shù)據(jù)處理清理上述序列，保留18-26bp的短核苷酸序列。18-26bp 的短核苷酸序列的表達(dá)豐度如圖1所示，從圖中可以看出，青蒿琥酯作用相關(guān)microRNA序 列長(zhǎng)度主要在20-23bp之間，符合microRNA序列的特性。
[0030] 5)參考miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)
[0031] 將步驟4得到的兩組18-26bp的核苷酸序列分別與miRBase 21. 0中日本血吸蟲 microRNAs的前體序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出匹配的microRNAs ;如表1所示，處理組中， 匹配的Pre-miRNA的個(gè)數(shù)為60,匹配的miRNA的個(gè)數(shù)為98 ;對(duì)照組中，匹配的Pre-miRNA的 個(gè)數(shù)為62,匹配的miRNA的個(gè)數(shù)為98,且兩組全部的匹配的Pre-miRNA的個(gè)數(shù)為62,全部的 匹配的miRNA的個(gè)數(shù)為103。
[0032] 表 1
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲microRNA的檢測(cè)方法，其特征在于由以下步驟 組成； (1) 動(dòng)物分組與尾蝴感染 將清潔級(jí)小鼠分為青蒿琥酯處理組和對(duì)照組，每只小鼠采用腹部貼片法感染尾蝴 180~200 條 / 只； (2) 藥物處理與蟲體總RNA抽提 青蒿琥酯（Art)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%羧甲基纖維素鈉水溶液，得到Art溶液；尾蝴感染 7天后給青蒿琥酯處理組的每只小鼠灌服Art溶液，藥物劑量為120mg/kg(每kg的小鼠 罐服120mg的Art)，對(duì)照組僅灌服與Art溶液相同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %羧甲基纖維素鈉 水溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 005%肝素鈉的生理鹽水溶液經(jīng)肝門 靜脈進(jìn)行灌注沖洗，得到兩組10日齡的日本血吸蟲，PBS漂洗日本血吸蟲3次；將漂洗后的 日本血吸蟲在-80°C下冷凍保存后，用Trizol試劑分別抽提兩組日本血吸蟲的總RNA; (3) 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 采用TruSeqSmallRNASamplePrep試劑盒分別對(duì)步驟2提取的兩組日本血吸蟲的 總RNA，構(gòu)建青蒿琥酯處理組的DNA文庫(kù)與對(duì)照組的DNA文庫(kù)；針對(duì)以上兩個(gè)DNA文庫(kù)，用 IlluminaHiseq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，讀長(zhǎng)為單端50bp; (4)原始數(shù)據(jù)去冗余 將步驟3測(cè)序得到的兩組測(cè)序結(jié)果，去除接頭序列、mRNA序列、RFam序列、重復(fù)序列和 非典型microRNA序列，保留18-26 bp的核苷酸序列； (5) 參考miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì) 將步驟4得到的兩組18-26 bp的核苷酸序列分別與miRBase 21. 0日本血吸 蟲microRNAs的前體序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出兩組18-26 bp的核苷酸序列中，與 microRNAs的前體序列匹配的microRNAs ; (6)青蒿琥醋作用相關(guān)microRNA差異表達(dá)分析 采用Fisherexact和Chi-squared2X2檢驗(yàn)方法比較步驟5中篩選出的匹配的microRNAs在兩組18-26bp的核苷酸序列中的表達(dá)豐度，篩選出差異倍數(shù)> 2或〈0.5 的microRNAs，同時(shí)計(jì)算表達(dá)豐度的顯著性指數(shù)（p-Value)，進(jìn)一步篩選出pvalue〈 0? 01 的microRNAs，即為顯著性差異microRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述顯著性差異microRNA為：如SEQ 10勵(lì).1所示的8]_31^1-2卜?5，如5￡〇10勵(lì).2所示的8]_31111?-12513，如5￡〇10勵(lì).3 所示的sja-miR-3505,如SEQ ID NO. 4所示的sja-miR-3504，如SEQ ID NO. 5所示的 8]_&1^1-348613，如5￡〇10勵(lì).6所示的8」31111?-3484-5口，以及如5￡〇10勵(lì).7所示的 sja-miR-2c-3p〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲microRNA的檢測(cè)方法，通過Solexa高通量測(cè)序技術(shù)鑒定與青蒿琥酯作用相關(guān)的microRNA。本發(fā)明首次鑒定了青蒿琥酯作用日本血吸蟲童蟲的相關(guān)microRNA，為深入研究microRNA在青蒿琥酯抗日本血吸蟲中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為新藥的研發(fā)提供潛在的藥物靶點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104726585
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510117214
【發(fā)明人】孔慶明, 陳睿, 童群波, 樓滌, 丁建祖, 鄭斌, 陳曉恒, 陸紹紅
【申請(qǐng)人】浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日