用于辛德比斯病毒熒光rt-pcr檢測(cè)的引物和lna探針及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè) 的引物和LNA探針及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 辛德比斯病毒（Sindbis virus, SINV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，為甲病毒屬的代 表株。1952年首次分離于埃及尼羅河三角洲辛德比斯地區(qū)采集的庫(kù)蚊中，命名為AR339株。 庫(kù)蚊和伊蚊是其傳播媒介，鳥(niǎo)類和家畜等脊椎動(dòng)物為其宿主。辛德比斯病毒感染為人畜共 患病，可引起人體發(fā)熱、頭痛、皮瘆、關(guān)節(jié)炎甚至腦炎，與登革熱、基孔肯雅熱等其他蟲(chóng)媒病 毒病癥狀類似。本病在世界上廣泛流行，非洲、亞洲、歐洲和大洋洲都有發(fā)生，印度、南非、澳 大利亞、俄羅斯和亞洲許多國(guó)家均從庫(kù)蚊樣本中分離到該病毒。辛德比斯病毒根據(jù)抗原性 不同可分為兩個(gè)組，一組為古北區(qū)（歐洲、喜馬拉雅山和長(zhǎng)江直到其人海口以北的亞洲、阿 拉伯北部、撒哈拉大沙漠以北的非洲）_埃塞俄比亞區(qū)，另一組為東方區(qū)-澳大利亞區(qū)。根 據(jù)核苷酸序列同源性分析，目前世界上已發(fā)現(xiàn)的辛德比斯病毒可分作亞洲/澳洲與歐洲/ 非洲兩大支系。
[0003] 隨著與世界各國(guó)交通往來(lái)的日益頻繁，境外一些來(lái)自疫區(qū)的人員和傳播媒介蚊類 可通過(guò)國(guó)境口岸進(jìn)入我國(guó)，存在著隨交通工具將辛德比斯病毒輸入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在國(guó) 境口岸建立一套針對(duì)人群和蚊類攜帶辛德比斯病毒的檢驗(yàn)鑒定方法，是檢驗(yàn)檢疫機(jī)關(guān)迫切 而重要的工作內(nèi)容之一。
[0004] LNA (Locked Nucleic Acid)是一種核酸類似物，和普通核酸分子區(qū)別在于在其碳 環(huán)的2'氧原子和4'碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此也稱鎖核酸。引入一個(gè) LNA堿基可對(duì)探針的TM值提高3-8攝氏度，可以大大縮短TaqMan探針的長(zhǎng)度，從而大大增 加探針的靈敏度及穩(wěn)定性，可使探針信號(hào)增強(qiáng)、信噪比增大。因此，選用LNA探針可以提高 檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性。為及時(shí)掌握國(guó)境口岸人群中疑似病例或媒介是否攜帶辛德比斯病 毒，有效地控制該類傳染病在國(guó)境口岸的傳入和輸出，保障廣大人民群眾的生命與健康，需 要建立一種實(shí)時(shí)、靈敏、穩(wěn)定快速的檢測(cè)鑒定手段，對(duì)在國(guó)境口岸積極有效防控辛德比斯感 染疫情、服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生事業(yè)發(fā)揮重要的現(xiàn)實(shí)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的引物 和LNA探針及其試劑盒。該引物探針和試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)辛德比斯病毒靈敏快速簡(jiǎn)便的檢 測(cè)。
[0006] 本發(fā)明的用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和探針，所述引物序列如SEQ ID NO : 1-2所示，所述LNA探針序列如SEQ ID NO :3所示。
[0007] 本發(fā)明的一種用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的試劑盒，包括無(wú) RNA酶的滅菌 雙蒸水、RT-PCR緩沖液、RT-PCR酶混合液、陽(yáng)性對(duì)照模板、陰性對(duì)照模板，還包括引物和LNA 探針，所述引物的核酸序列如SEQ ID NO :1-2所示；所述LNA探針的核酸序列如SEQ ID NO: 3所示，引入LNA的堿基用下劃斜體字母表示。具體序列如表1所示，表1是辛德比斯病毒 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和LNA探針列表。
[0008] 表 1
[0009]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和LNA探針，其特征在于，所述引物序列 如SEQ ID NO : 1-2所示，所述LNA探針序列如SEQ ID NO :3所示。
2. -種用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括無(wú) RNA酶的滅菌 雙蒸水、RT-PCR緩沖液、RT-PCR酶混合液、陽(yáng)性對(duì)照模板和陰性對(duì)照模板，其特征在于，還 包括引物和LNA探針； 所述引物序列如SEQ ID NO : 1-2所示； 所述LNA探針序列如SEQ ID NO :3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述LNA探針序列5' -FAM-C ￡ A 4 A I： GA ￡< C 4 T G C - BHQ1-3'中用下劃斜體字母表示的堿基是LNA堿基。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和LNA探針及其試劑盒。本發(fā)明的用于辛德比斯病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的引物，序列如SEQ ID NO：1-2所示，探針序列如SEQ ID NO：3所示。本發(fā)明的試劑盒，包括無(wú)RNA酶的滅菌雙蒸水、RT-PCR緩沖液、RT-PCR酶混合液、陽(yáng)性對(duì)照模板、陰性對(duì)照模板，還包括引物和LNA探針，所述引物的序列如SEQ ID NO：1-2所示；所述探針的序列如SEQ ID NO：3所示。本發(fā)明為辛德比斯病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，特別是為國(guó)境口岸人群及蚊類攜帶辛德比斯病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)提供了靈敏特異快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104726615
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510172263
【發(fā)明人】洪燁, 鄭夔, 戴俊, 袁帥, 師永霞, 黃吉城
【申請(qǐng)人】廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月13日