通過e3泛素連接酶增強(qiáng)靶蛋白質(zhì)及其他多肽降解的化合物和方法
【專利說(shuō)明】通過E3泛素連接酶增強(qiáng)靶蛋白質(zhì)及其他多肽降解的化合 物和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及雙功能化合物，其被發(fā)現(xiàn)作為靶向泛素化的調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用性，特別是 作為多種被根據(jù)本發(fā)明所述的雙功能化合物降解和/或以其他方式抑制的多肽及其他蛋 白質(zhì)的抑制劑。具體地，本發(fā)明涉及這樣的化合物：其一端包含結(jié)合VHLE3泛素連接酶的 VHL配體（定義為泛素配體結(jié)合部分或ULM I基團(tuán))并且另一端包含結(jié)合靶蛋白質(zhì)的部 分（定義為蛋白質(zhì)/多肽革巴向部分或|ptm|基團(tuán))，使得靶蛋白質(zhì)/多肽被置于鄰近泛素 連接酶，以引起該蛋白質(zhì)降解（和抑制）。本發(fā)明呈現(xiàn)與根據(jù)本發(fā)明所述的化合物有關(guān)的與 靶向多肽降解/抑制一致的寬范圍藥理活性。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)和準(zhǔn)許支持
[0003] 本申請(qǐng)要求2011年1月12日提交的相同標(biāo)題的臨時(shí)申請(qǐng)US61/585, 769的優(yōu)先 權(quán)利益，其全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考。
[0004] 本發(fā)明是以國(guó)家衛(wèi)生研究院（the National Institutes of Health)的準(zhǔn)許號(hào) AI084140在政府支持下完成的。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] E3泛素連接酶（其中超過600種被人類所知）1為泛素化給予底物特異性，并且由 于其對(duì)某些蛋白質(zhì)底物的特異性，是比一般蛋白酶體抑制劑 3,4更具吸引力的治療靶。雖然 E3連接酶的配體的發(fā)展已被證實(shí)困難--部分是由于其一定會(huì)中斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互 作用5的事實(shí)，但進(jìn)來(lái)的發(fā)展已經(jīng)提供結(jié)合（bind)這些連接酶的特異性配體。蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用眾所周知由于其大接觸表面和所含淺溝或平界面是難以用小分子靶向的。相 反，大多數(shù)小分子藥物結(jié)合在嚴(yán)密而明確的袋中的酶或受體 6。自發(fā)現(xiàn)nutlins--第一種 小分子E3連接酶抑制劑7--以來(lái)，已報(bào)告靶向凋亡蛋白質(zhì)（IAPs) 8'9、SCFMet3(ll°、和SCFede411 的抑制劑的其他化合物；但是，該領(lǐng)域仍處于發(fā)展中。
[0007] -種具有令人振奮的治療潛力的E3連接酶是馮希佩爾-林道（VHL)腫瘤抑制 劑--E3連接酶復(fù)合物VCB的底物識(shí)別亞單位，其也由延伸蛋白B和C、Cul2和Rbxl組成 12。VHL的主要底物是低氧誘導(dǎo)因子I a (HIF-1 α )，響應(yīng)低氧水平上調(diào)基因如促血管生長(zhǎng)因 子VEGF和紅細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子的促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)錄因子。雖然HIF-I α被組成型表 達(dá)，但其胞內(nèi)水平在常氧條件下保持很低--通過脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域（PHD)蛋白使其羥 基化和隨后的VHL介導(dǎo)的泛素化（圖1)。
[0008] 采用合理的設(shè)計(jì)，我們已生成馮希佩爾-林道（VHL)的第一種小分子配體--E3 連接酶VCB的底物識(shí)別亞單位，在癌癥、慢性貧血和缺血中重要的靶標(biāo) 2。我們還已獲得具 有我們的最有效配體15的VHL的晶體結(jié)構(gòu)，確定該化合物模擬轉(zhuǎn)錄因子HIF-I a--VHL 的主要底物--的結(jié)合模式。
[0009] 從較早的結(jié)合VHL的羥基化HIF肽的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究中，已經(jīng)清楚羥脯氨酸 在介導(dǎo)這種蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用?；谠擁?xiàng)工作，發(fā)明人研發(fā)了羥基化 HIF肽：VHL熒光極化（FP)結(jié)合分析，借此他們分析了 >120種具有側(cè)接非肽部分的中心羥 脯氨酸殘基的化合物。深化該研究，發(fā)明人現(xiàn)已研究出與七種頂端化合物復(fù)合的VHL的共 晶體結(jié)構(gòu)。對(duì)這些配體結(jié)合結(jié)構(gòu)的分析驅(qū)使下一代VHL配體的設(shè)計(jì)/合成，下一代VHL配 體與蛋白質(zhì)結(jié)合部分連接以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的雙功能化合物。
[0010] 本發(fā)明的主要理論依據(jù)是我們的普羅太克（PROTAC)(蛋白水解靶向嵌合體）技 術(shù)需要小分子E3連接酶配體。該技術(shù)將靶向的蛋白質(zhì)/多肽引至E3連接酶，以進(jìn)行泛素 化和隨后的蛋白酶體降解。在幾個(gè)思路證明實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人證明了利用來(lái)自結(jié)合VHL的 HIF的短肽序列的這種方法的應(yīng)用性。為制成更'像藥物'的普羅太克，本發(fā)明人已用'小 分子' VHL配體替代HIF肽，從而提供將蛋白質(zhì)募集至E3連接酶以進(jìn)行泛素化和降解的方 式，從而最終提供基于這種蛋白質(zhì)降解的療法。
[0011] 發(fā)明目的
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有將內(nèi)源蛋白質(zhì)募集至E3泛素連接酶以進(jìn)行降解的 功能的化合物。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供調(diào)節(jié)患者或?qū)ο髢?nèi)蛋白質(zhì)降解并且可用于治療通過降 解蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病狀態(tài)或狀況的化合物。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供基于上述調(diào)節(jié)劑--特別是包括用于患者或?qū)ο蟮闹?療處理的抑制劑-的藥物組合物，該患者或?qū)ο髢?yōu)選包括人患者或?qū)ο蟆?br>[0015] 本發(fā)明的又一目的是提供確定結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合部分的方法。
[0016] 本發(fā)明的再一目的是提供鑒定生物學(xué)系統(tǒng)--特別是包括人系統(tǒng)--中結(jié)合根 據(jù)本發(fā)明所述的化合物的蛋白質(zhì)結(jié)合部分的內(nèi)源蛋白質(zhì)的方法。
[0017] 本發(fā)明的再一目的是提供利用根據(jù)本發(fā)明所述的化合物鑒定降解生物學(xué)系統(tǒng)中 的目標(biāo)蛋白質(zhì)的效果的方法。
[0018] 本發(fā)明的再一方面是提供治療患者的方法，其中靶向的蛋白質(zhì)降解將產(chǎn)生目的治 療效果。
[0019] 本發(fā)明的另一目的是提供可用于第一醫(yī)療應(yīng)用的化合物和組合物。
[0020] 本發(fā)明的再一方面是提供用于治療患者的化合物和/或組合物，其中靶向的蛋白 質(zhì)降解將產(chǎn)生目的治療效果。
[0021] 本發(fā)明的這些和/或其他目目的中的任意一個(gè)或多個(gè)可通過對(duì)本發(fā)明下文描述 的常規(guī)閱讀而顯而易見。
[0022] 附圖簡(jiǎn)述
[0023] 圖1顯示（A)HIF-I α積累導(dǎo)致低氧響應(yīng)涉及的基因如促紅細(xì)胞生成素和VEGF的 轉(zhuǎn)錄上調(diào)。（B)在常氧條件下，HIF-Ia被羥基化，被VHL識(shí)別，被泛素化和被蛋白酶體降 解，從而防止轉(zhuǎn)錄上調(diào)。
[0024] 圖 2. WaterLOGSY NMR 光譜顯示 3 而非 L-Hyp 或 NAc-Hyp-NMe 與 VHL 結(jié)合。
[0025] 圖3顯示圖形表示顯示15和VHL之間的關(guān)鍵相互作用。
[0026] 圖4顯示結(jié)合VHL的15(最輕灰色碳）的2.9 A共晶體結(jié)構(gòu)，表示其結(jié)合模擬 HIF-Ia肽（輕灰色碳，pdb 1LM817)的結(jié)合。
[0027] 圖5顯示V54BC apo (A)的晶體結(jié)構(gòu)和在與15的復(fù)合物⑶中的晶體結(jié)構(gòu)。Hyp結(jié) 合位點(diǎn)殘基（條狀，黃色碳）和保守水分子（紅色點(diǎn)）以及15(條狀，青色碳）周圍疊加的 電子密度（2&-F。）顯示為藍(lán)色，并且在1.2 〇呈波狀。蛋白質(zhì)表面顯示50%透明度，為綠 色。
[0028] 圖6-12Α和B顯示在描述的VHL極化/移位分析中根據(jù)本發(fā)明所述的各個(gè)化合物 的活性。根據(jù)本發(fā)明所述的化合物在各圖頂部用編號(hào)標(biāo)示。對(duì)照化合物顯示在圖15Β中， 并且充當(dāng)最小極化（最大移位），以進(jìn)行比較。顯示的抑制百分比通過相對(duì)于最大和最小極 化標(biāo)準(zhǔn)化而確定，和相對(duì)于log[VL]作圖。每次重復(fù)（η = 9)的IC5tl值利用Prism 5確定， 然后平均化以確定平均IC5tl和平均值誤差標(biāo)準(zhǔn)（SEM)。
[0029] 圖13 (連同表2-親和力表）顯示根據(jù)本發(fā)明所述的多種示例性化合物。
[0030] 圖14顯示根據(jù)本發(fā)明所述的、來(lái)自表2的多種優(yōu)選化合物。
[0031] 圖15顯示更多根據(jù)本發(fā)明所述的化合物和其活性。多數(shù)化合物在100μΜ濃度以 下具有活性。
[0032] 圖16顯示根據(jù)本發(fā)明所述的、來(lái)自圖15的多種優(yōu)選的化合物。
[0033] 圖17顯示根據(jù)本發(fā)明所述的來(lái)自圖15的八種特別優(yōu)選的化合物。
[0034] 圖18顯示根據(jù)本發(fā)明所述的六種優(yōu)選的化合物，其包含連接至優(yōu)選的泛素配體 結(jié)合部分的雌激素結(jié)合蛋白靶向部分。
[0035] 圖19顯示根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選化合物種類。
[0036] 發(fā)明概述
[0037] 本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：一旦泛素途徑蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)通過結(jié)合泛素途徑蛋白質(zhì) 和靶蛋白質(zhì)的嵌合構(gòu)建體被鄰近安置，泛素途徑蛋白質(zhì)就使任何靶蛋白質(zhì)泛素化。因此，本 發(fā)明提供導(dǎo)致選定靶蛋白質(zhì)泛素化的組合物。本發(fā)明還提供組合物庫(kù)及其應(yīng)用。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的組合物。組合物包括根 據(jù)限定化學(xué)結(jié)構(gòu)的泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分（優(yōu)選用于Ε3泛素連接酶，單獨(dú)或與Ε2泛素 結(jié)合酶的復(fù)合物，該Ε2泛素結(jié)合酶負(fù)責(zé)將泛素轉(zhuǎn)移至靶向的蛋白質(zhì)）和蛋白質(zhì)靶向部分， 其優(yōu)選通過連接體連接在一起，其中泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分識(shí)別泛素途徑蛋白質(zhì)，并且 靶向部分識(shí)別靶蛋白質(zhì)，并且其中泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分偶聯(lián)于靶向部分。
[0039] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供化合物庫(kù)。該庫(kù)包括一種以上化合物，其中每種組 合物均具有式Α-Β，其中A是泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分（優(yōu)選地，Ε3泛素連接酶部分，如本 文另外公開），并且B是分子庫(kù)的蛋白質(zhì)結(jié)合部件，其中A偶聯(lián)（優(yōu)選地，通過連接體部分） 于Β，并且其中泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分識(shí)別泛素途徑蛋白質(zhì)，具體地，Ε3泛素連接酶。在
【具體實(shí)施方式】中，該庫(kù)包含Ε3泛素連接酶的VHL的特異性泛素化識(shí)別肽（泛素途徑蛋白質(zhì) 結(jié)合部分，如本文另外公開）和隨機(jī)靶蛋白質(zhì)結(jié)合元件（例如，化學(xué)化合物庫(kù)）。因此，靶蛋 白質(zhì)未被提前確定，并且該方法可用于確定在通過泛素連接酶降解后假定蛋白質(zhì)結(jié)合元件 的活性及其作為靶的藥理值。
[0040] 在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供篩選本發(fā)明的庫(kù)以識(shí)別包含靶向部分的化合物的 方法，該靶向部分識(shí)別與細(xì)胞預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)。方法包括用庫(kù)實(shí)體群（pool of entities)培育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；鑒定改變細(xì)胞預(yù)定功能的實(shí)體群；用來(lái)自被鑒定 的實(shí)體群的組合物培育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；和鑒定改變細(xì)胞預(yù)定功能的組合物，其 中被鑒定的組合物包含識(shí)別與預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)的靶向部分。
[0041] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供篩選本發(fā)明的庫(kù)以識(shí)別包含靶向部分的組合物的 方法，該靶向部分識(shí)別與細(xì)胞預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)。方法包括用來(lái)自庫(kù)的各組合物培 育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；鑒定改變細(xì)胞預(yù)定功能的組合物；其中被鑒定的組合物包含 識(shí)別與預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)的靶向部分。
[0042] 在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供鑒定與細(xì)胞預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)的方法。方 法包括用來(lái)自本發(fā)明的庫(kù)的組合物培育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；鑒定改變細(xì)胞預(yù)定功能 的組合物；鑒定結(jié)合被鑒定的組合物的靶蛋白質(zhì)，其中靶蛋白質(zhì)與細(xì)胞預(yù)定功能相關(guān)。 [0043] 在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供鑒定與細(xì)胞預(yù)定功能相關(guān)的靶蛋白質(zhì)的方法。方 法包括用來(lái)自本發(fā)明的庫(kù)的實(shí)體群培育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；鑒定改變細(xì)胞預(yù)定功能 的實(shí)體群；用來(lái)自被鑒定的實(shí)體群的組合物培育細(xì)胞；監(jiān)測(cè)細(xì)胞預(yù)定功能；鑒定改變細(xì)胞 預(yù)定功能的組合物；和鑒定結(jié)合被鑒定的組合物的靶蛋白質(zhì)，其中靶蛋白質(zhì)與細(xì)胞預(yù)定功 能相關(guān)。
[0044] 在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供泛素化/降解細(xì)胞中的靶蛋白質(zhì)的方法。方法包 括給予雙功能組合物，該雙功能組合物包括泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分和靶向部分，其優(yōu)選 通過連接體部分連接，如本文另外描述，其中泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分偶聯(lián)于靶向部分，并 且其中泛素途徑蛋白質(zhì)結(jié)合部分識(shí)別泛素途徑蛋白質(zhì)（例如，泛素連接酶，優(yōu)選E3泛素連 接酶），并且靶向部分識(shí)別靶蛋白質(zhì)，使得當(dāng)靶蛋白質(zhì)被置于鄰近泛素連接酶時(shí)發(fā)生靶蛋白 質(zhì)降解，由此導(dǎo)致降解/抑制靶蛋白質(zhì)的作用和控制蛋白質(zhì)水平。本發(fā)明給予的蛋白質(zhì)水 平控制提供疾病狀態(tài)或狀況的治療--經(jīng)由靶蛋白質(zhì)、通過降低患者細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的水 平來(lái)調(diào)節(jié)。
[0045] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及治療需要通過蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)或狀況的患 者的方法，其中該蛋白質(zhì)的降解會(huì)在該患者中產(chǎn)生治療效果，方法包括給予有需要的患者 有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的化合物，任選地組合另一生物活性劑。疾病狀態(tài)或狀況可以是 微生物劑或其他外源劑如病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或其他微生物引起的疾病，或可以是 導(dǎo)致疾病狀態(tài)和/或狀況的蛋白質(zhì)過表達(dá)所引起的疾病狀態(tài)。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)下列結(jié)構(gòu)的化合物：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 根據(jù)下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物： 其中L是連接體基團(tuán)，并且
是泛素連接酶結(jié)合部分，其中所述連接體基團(tuán)任選地進(jìn)一步連接于i 團(tuán)。
2. 根據(jù)下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物：
其4
是泛素連接酶結(jié)合部分；
是化學(xué)部分（蛋白質(zhì)靶部分），其結(jié)合將要通過泛素連接酶降解的靶蛋白質(zhì)或 多肽，并且直接或通過連接體部分L化學(xué)連接于
基團(tuán)，其也是泛素連接酶結(jié)合部分，其可與
基團(tuán)相同或不同并且直接或通過連接 體部分連接吁
基團(tuán)；和 L是連接體部分，其可存在或不存在，并且在存在時(shí)，化學(xué)地（共價(jià)地）連接
與
或 1-1， 其藥學(xué)上可接受的鹽、對(duì)映體、立體異構(gòu)體、溶劑化物或多晶型物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其爿
：團(tuán)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中
是根據(jù)下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的基 團(tuán)：
其中R1'是任選取代的C1-C6烷基、任選取代的-(CH2) n0H、任選取代的-(CH2) nSH、任選 取代的（CH2)n-O-(C1-C6)烷基、包含環(huán)氧化物部分的任選取代的（CH 2)n-WCHOCHW-(Cci-C6)烷 基，其中W獨(dú)立地不存在或是H、任選取代的-(CH 2) nC00H、任選取代的-(CH2) nC (0) - (C1-C6 烷基）、任選取代的-(CH2) JR1R2、任選取代的-(CH2) nNHC (0) -R1、任選取代的-(CH2) nC (0) -NR1R2、任選取代的-(CH2)n0C (0) -NR1R2、- (CH2O)nH、任選取代的-(CH2)n0C (0) - (C1-C6 烷基）、任選取代的-(CH2) nC (0) -0- (C1-C6烷基）、任選取代的-(CH 20) nC00H、任選取代 的-(OCH2)n0- (C1-C6烷基）、任選取代的-(CH 20)nC (0) - (C1-C6烷基）、任選取代的-(0CH 2) nNHC (0) -R1、任選取代的-(CH2O) nC (0) -NR1R2、- (CH2CH2O) nH、任選取代的-(CH2CH2O) nC00H、任 選取代的-(OCH2CH2) n0- (C1-C6烷基）、任選取代的-(CH 2CH20) nC (0) - (C1-C6烷基）、任選取代 的-(OCH2CH2) JHC(O)-R1、任選取代的-(CH2CH2O) W(O)-NR1R2、任選取代的-SO2Rs、任選取代 的S(0)R s、N02、CN或鹵素（F、Cl、Br，I，優(yōu)選F或Cl); 札和R 2各自獨(dú)立地是H或C「C6烷基，其可任選地用一個(gè)或兩個(gè)羥基或上至三個(gè)鹵素 基團(tuán)（優(yōu)選氟）取代； 馬是C ^C6烷基、任選取代的芳基、雜芳基或雜環(huán)基團(tuán)或-(CH JmNR1R2基團(tuán)， 父和父'各自獨(dú)立地是(：_0、(：_5、-5(0)、5(0)2，（優(yōu)選父和父'均為(：_0); R2'是任選取代的-(CH2)n-(C = O)u(NR1)v(SO2)w(C 1-C6)烷基、任選取代的 RinR2n- (CH2) n-(C = 0) u (NR1) v (SO2)wNRinR2n基團(tuán)、任選取代的-(CH 2) n-(C = 0) u (NR1) V(SO2)w-芳基、 任選取代的-(CH2) n- (C = 0) u (NR1) v (SO2) w-雜芳基、 任選取代的-(CH2) n- (C = 0) JR1 (SO2) w-雜環(huán)、 任選取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任選取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1NR2N、 任選取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1C (0) R1n、 任選取代的-NR1-(CH2) n-(C = C^u(NR1) v (SO2)w-芳基、 任選取代的-NR1-(CH2) n-(C = 0) u (NR1)v (SO2)w-雜芳基或 任選取代的-NR1-(CH2) n-(C = OhNR1 (SO2)w-雜環(huán)、 任選取代的-Kr2 -C1-C6烷基； 任選取代的-χΚ2' -芳基； 任選取代的-χΚ2' -雜芳基； 任選取代的-χΚ2'-雜環(huán)基團(tuán)； R3'是任選取代的C1-C6烷基、 任選取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任選取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1NR2N、 任選取代的-(CH2)n-C(O)u(NR1) v(SO2)w-NR1C(O)IV 任選取代的-(CH2)n-C(O)u(NR1) v(SO2)w-C(O)NR1Rp 任選取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-芳基、 任選取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-雜芳基、 任選取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-雜環(huán)、 任選取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任選取代的-NR1- (CH2)