用于生成植物的熒光激活細胞分選(facs)富集的制作方法
【專利說明】用于生成植物的熒光激活細胞分選（FACS)富集
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月7日提交的、流水號61/697, 890的美國臨時專利申請的 優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本公開文本涉及用于生成植物的熒光激活細胞分選的領(lǐng)域。在一個優(yōu)選實施方案 中，本公開文本描述了用于生成可繁殖的、經(jīng)過編輯的植物的經(jīng)過編輯的、可再生的原生質(zhì) 體的FACS富集。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 焚光激活細胞分選儀（FACS)是由 Bonner、Sweet、Hulett、Herzenberg、及其他 人在二十世紀(jì)六十年代晚期發(fā)明的，用于進行可存活細胞的細胞分選和流式細胞計量術(shù)。 Becton Dickinson免疫細胞計量術(shù)系統(tǒng)在二十世紀(jì)七十年代早期引入商業(yè)性機器。熒光激 活細胞分選（FACS)是一種專門化類型的流式細胞計量術(shù)。它提供一種方法，基于每個細胞 的特定光散射和熒光特征，將生物學(xué)細胞的異質(zhì)混合物分選入兩個或更多個容器，一次一 個細胞。它是一種有用的科學(xué)儀器，因為它提供來自細胞個體的熒光信號的快速、客觀且定 量記錄以及有特定興趣的細胞的物理分出。
[0006] 細胞懸浮液在較窄、快速流動的液體流的中央帶走。流動是安排好的，使得細胞之 間相對于它們的直徑有較大的分開。振蕩機制引起細胞流斷成各個小滴。調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使得 每個小滴超過一個細胞的概率較低。剛好在液流斷成小滴之前，流動穿過熒光測量站，在那 里測量每個細胞的感興趣熒光特征。將一個充電環(huán)恰好放置在液流斷成小滴的點。根據(jù)剛 剛之前的熒光強度測量，在環(huán)上放置一個電荷，并在自液流斷成小滴時在小滴上捕獲相反 的電荷。然后，帶電荷的小滴落入、穿過靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)根據(jù)小滴的電荷將它們轉(zhuǎn)向 入容器。在一些系統(tǒng)中，將電荷直接應(yīng)用液流，而且小滴中斷保留與液流相同符號的電荷。 然后，在小滴中斷后，液流恢復(fù)中性。
[0007] 較寬范圍的熒光團可用作流式細胞計量術(shù)中的標(biāo)記物。通常將熒光團（或簡稱 "fluor"）附著于識別細胞上或細胞中的靶特征的抗體；也可以將它們附著于對細胞膜或 其它細胞結(jié)構(gòu)具有親和力的化學(xué)實體。每種熒光團具有特征性的峰激發(fā)和發(fā)射波長，而且 發(fā)射譜常常交疊。因而，可使用的標(biāo)記物的組合取決于用于激發(fā)熒光染料的燈或激光的波 長及可用的檢測儀。
[0008] 熒光激活細胞分選（FACS)提供自細胞的異質(zhì)混合物分離大數(shù)目熒光標(biāo)記細胞的 一種快速手段。具有熒光標(biāo)志物基因諸如綠色熒光蛋白（GFP)的細胞類型特異性表達的轉(zhuǎn) 基因植物的收集理想地適合于各種細胞類型的FACS輔助研宄。
[0009] 已經(jīng)證明植物原生質(zhì)體的流式細胞計量術(shù)分析和熒光激活細胞分選（FACS)是 可實施的，而且，這種技術(shù)已經(jīng)在許多不同研宄領(lǐng)域產(chǎn)生有價值的結(jié)果（Harkins and Galbraith, 1984 ;Galbraith et al·，1995 ;Sheen et al·，1995)。例如，來自表達組織特 異性熒光蛋白標(biāo)志物的擬南芥植物的原生質(zhì)體的FACS已經(jīng)用于檢查特定細胞類型中的基 礎(chǔ)和環(huán)境刺激的轉(zhuǎn)錄譜二者（Birnbaum et al.，2003 ;Brady et al.，2007 ;Gifford et al.，2008 ;Dinneny et al.，2008)，而且流式細胞計量術(shù)已經(jīng)用于分析煙草原生質(zhì)體中的 反應(yīng)性氧種類生成和程序性細胞死亡（Nicotiana tabacum;Lin et al.，2006)。有較寬選 集的熒光工具可用于研宄植物中的眾多生理學(xué)參數(shù)，例如，與熒光蛋白融合的順式調(diào)節(jié)元 件（Haseloff and Siemering, 2006)、遺傳編碼的分子傳感器（Looger et al.，2005)或基 于染料的傳感器（Haugland，2002)可以與細胞計量術(shù)組合用于測量多種多樣的生物學(xué)過 程。然而，由于測定法的靈敏度，這種方法有某些無效，因此仍有改進的空間。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本公開文本的一個特定實施方案涉及一種通過利用目的多核苷酸分離植物原生 質(zhì)體、自一群植物細胞生成植物的方法，該方法通過下述步驟來進行：提供具有至少一個包 含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體，其中該群基本上沒有包含 熒光標(biāo)志物且不包含目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體；其中該植物原生質(zhì)體由藻酸鈉封裝； 自該群中的其余植物原生質(zhì)體分出至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體， 由此分離包含目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體；自所述分離的植物原生質(zhì)體再生植物；并培 養(yǎng)所述植物。
[0012] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以是通過分離包含整合入植物原生質(zhì)體基因組 的目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體而再生的植物，這通過下述步驟來進行：提供具有至少一 個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體；其中該植物原生質(zhì)體 由藻酸鈉封裝；自該群包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體回收微愈傷組織，其中 該至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體已經(jīng)用目的多核苷酸和編碼熒光 標(biāo)志物的多核苷酸轉(zhuǎn)化；自所述微愈傷組織再生植物；并培養(yǎng)所述植物。
[0013] 備選實施方案包括用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法可包括提供具有至少一個 包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體，其中該至少一個原生質(zhì) 體包含位點特異性核酸酶，使得目的多核苷酸能夠通過位點特異性核酸酶的識別位點處的 同源重組整合在至少一個植物原生質(zhì)體的基因組中且其中該植物原生質(zhì)體由藻酸鈉封裝； 自該群中的其余植物原生質(zhì)體分出至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體； 自至少一個原生質(zhì)體再生轉(zhuǎn)基因植物；并培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
[0014] 根據(jù)下述數(shù)個實施方案的詳細描述，上述和其它特征會變得更加明顯，這參照附 圖進行。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1A-1E :顯示FAD2基因序列的序列比對，這是使用ALIGNX?生成的。
[0017] 圖2 :顯示FAD2基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，這是使用JALVIEW? v2. 3基于鄰居連 接距離生成的。
[0018] 圖3A-3M' ：顯示FAD3基因序列的序列比對，這是使用ALIGNX?生成的。
[0019] 圖4 :顯示FAD3基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，這是使用JALVIEW? v2. 3基于鄰居連 接距離生成的。標(biāo)記的序列對應(yīng)下述各項：FAD3A' /A"貫穿本申請描述為FAD3A' ；單元型 2貫穿本申請描述為FAD3C' ；單元型1貫穿本申請描述為FAD3C";和，單元型3貫穿本申請 描述為FAD3A"。
[0020] 圖5 :顯示pDAB104010的質(zhì)粒圖，它是一種代表性鋅指核酸酶表達盒。這種構(gòu)建 物的布局對其它ZFN表達盒是相似的，其中鋅指域（24828和24829)與上文描述的備選鋅 指域交換。
[0021] 圖6 :是一幅例示性多線圖，顯示每10, 000個序列讀出中在靶ZFN位點處具有刪 除的序列讀出的數(shù)目。圖上的X軸表示刪除的堿基的數(shù)目，Y軸表示序列讀出的數(shù)目，而Z 軸表示顏色編碼的樣品身份，如圖右邊描述的。顯示的具體例子是含有3個靶ZFN位點（A、 B和C)的FAD2基因家族基因座1的，評估四個基因家族成員和兩個對照轉(zhuǎn)染（作為對照樣 品A和B)。
[0022] 圖7 : (A)圖軸的詳情如圖6。該圖展示來自靶向FAD2基因家族基因座4的ZFN的 數(shù)據(jù)。該基因座含有兩個ZFN位點和兩個必需的對照轉(zhuǎn)染。圖7 :(B)ZFN靶位點周圍的具 體序列背景（SEQ ID NO: 471-480)，鑒定含有C、T和G的三核苷酸重復(fù)的FAD2A和C，導(dǎo)致 經(jīng)由FAD2A和C基因座測序觀察到的單堿基刪除增多。
[0023] 圖8 :顯示pDAS000130的質(zhì)粒圖。
[0024] 圖9 :顯示pDAS000271的質(zhì)粒圖。
[0025] 圖10 :顯示pDAS000272的質(zhì)粒圖。
[0026] 圖11 :顯示pDAS000273的質(zhì)粒圖。
[0027] 圖12 :顯示pDAS000274的質(zhì)粒圖。
[0028] 圖13 :顯示pDAS000275的質(zhì)粒圖。
[0029] 圖14 :顯示pDAS000031的質(zhì)粒圖。
[0030] 圖15 :顯示pDAS000036的質(zhì)粒圖。
[0031] 圖16 :顯示pDAS000037的質(zhì)粒圖。
[0032] 圖17 :圖示一種ETIP和有效載荷核酸構(gòu)造，以及植物細胞基因組中ETIP位點處 的靶定有效載荷的產(chǎn)物。
[0033] 圖18 :圖示原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，接著是使用3'和5'端二者處的截短型可評分和可 選擇標(biāo)志物的重建，宿主系中ETIP處的靶定有效載荷DNA的FACS選擇。
[0034] 圖19A和19B:圖示ETIP蕓苔事件的同源性定向修復(fù)，其源自鋅指核酸酶 (PDAS000074或pDAS000075)對基因組基因座的雙鏈DNA切割及后續(xù)的Ds-red供體 (pDAS000068、pDAS000070、或pDAS000072)進入蕓苔染色體ETIP基因座的整合。供體整合 入基因組基因座產(chǎn)生完全功能性、高表達Ds-red轉(zhuǎn)基因。
[0035] 圖20 :顯示蕓苔原生質(zhì)體的FACS分選和用pDAS000031 ("pDAS31"）轉(zhuǎn)染的蕓苔原 生質(zhì)體的計算轉(zhuǎn)染效率。另外，提供未轉(zhuǎn)化蕓苔原生質(zhì)體的FACS分選結(jié)果作為陰性對照。
[0036] 圖21 :顯示蕓苔原生質(zhì)體的FACS分選和用pDAS000064/pDAS000074(頂部圖）和 pDAS000064/pDAS000075 (底部圖）轉(zhuǎn)染的蕓苔ETIP原生質(zhì)體事件的計算轉(zhuǎn)染效率。
[0037] 圖22 :顯示蕓苔原生質(zhì)體的FACS分選和用pDAS000068/pDAS