鄰苯二甲酸二(α-乙基己)酯半抗原、人工抗原及其抗體制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，更具體的說，本發(fā)明涉及鄰苯二甲酸二（α-乙基己） 酯半抗原合成、人工抗原和抗體制備，還涉及上述鄰苯二甲酸二（α-乙基己）酯半抗原及 其相應(yīng)的人工抗原和抗體的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二（α -乙基己）酯（Di (2-ethylhexyl) phthalate)，英文縮寫 DEHP, 又名鄰苯二甲酸二辛酯，分子量為390. 5, 25°C時(shí)該品在水中溶解度〈0.01%，溶于大多數(shù) 有機(jī)溶劑和烴類，其結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DEHP半抗原，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)式為：
η為4或5〇
2. -種DEHP人工抗原，是由權(quán)利要求1所述的DEHP半抗原與載體蛋白結(jié)合而成，其特 征在于：所述DEHP人工抗原分子結(jié)構(gòu)式為：
η為4或5 ;所述的載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。
3. -種DEHP抗體，是能與權(quán)利要求2所述的DEHP人工抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免 疫球蛋白。
4. 如權(quán)利要求1所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于包括以下步驟： (1)按投料比為2:1~3:1將濃硝酸與DEHP置于圓底燒瓶中，冰浴條件下滴加到2倍 于濃硝酸量的濃硫酸中，磁力攪拌，反應(yīng)至室溫，再60°C回流反應(yīng)5h，期間用TLC監(jiān)控。用 lm〇L/L的氫氧化鈉溶液中和反應(yīng)液至弱堿性，乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上 減壓蒸干得到粗的硝化產(chǎn)物DEHP-NO 2，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為2:1~3:1的氯仿/ 環(huán)己烷洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的硝化產(chǎn)物DEHP-NO 2 ; ⑵按投料比為1:3:3將DEHP-N02、NH4CU鐵粉置于圓底燒瓶中，添加到適量的70% 乙醇溶液中，磁力攪拌，50°C回流反應(yīng)5h，期間用TLC監(jiān)控；反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入 IOOmL無水乙醇，濾去鐵粉，收集濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干；向濃縮液中加30mL水，用乙 酸乙酯萃取3次，收集有機(jī)相，蒸干，得到粗產(chǎn)物DEHP-NH 2 ;過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為 5:1~4:1的氯仿/甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的還原產(chǎn)物DEHP-NH 2 ; (3)將0.1 mmoL純化的DEHP-NH2與0. 15mmoL酸酐于無水吡啶中40°C攪拌反應(yīng)過夜， 反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到黏稠液體，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為6:1~4:1的氯仿/ 甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到產(chǎn)物即為DEHP半抗原。
5. 如權(quán)利要求4所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于：濃硝酸為65 %的硝酸，酸 酐為丁二酸酐或戊二酸酐。
6. 權(quán)利要求2所述DEHP人工抗原的制備方法為活潑脂法與混合酸酐法，其特征在于： 所述活潑酯方法為： (1) 將0.1 mmol的DEHP半抗原溶解于ImL的DMF中，然后在該溶液里加入等摩爾的DCC 和NHS，室溫避光反應(yīng)過夜； (2) 4°C離心去除沉淀，取上清液，并將其緩慢加入到5mL pH9. 5的碳酸緩沖液中，其緩 沖液含有載體蛋白BSA或OVA，其中載體蛋白的濃度為10~15mg/mL，在4°C下反應(yīng)過夜； (3)將步驟（2)中的反應(yīng)液裝入透析袋，用0.9%的生理鹽水透析3d，得到人工抗原； 所述混合酸酐法為： (1) 將0.1 mmol DEHP半抗原溶于ImL DMF中，加入80 μ L正三丁胺，冰浴下緩慢滴加 0. 15mmol氯甲酸異丁酯，4°C攪拌反應(yīng)Ih,此為甲液； (2) 將60mg載體蛋白BSA或OVA溶于5mLlmol/L pH9. 6的碳酸氫鈉緩沖液中，此為乙 液； (3) 將甲液緩慢滴加到乙液中，4°C磁力攪拌反應(yīng)過夜，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，然 后用0. 9 %的生理鹽水透析3d，得到人工抗原。
7. 如權(quán)利要求3所述DEHP抗體的制備方法，其特征在于： (1) 實(shí)驗(yàn)選用2個(gè)月左右的健康雌性的Balb/c小鼠或新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，免疫劑 量基礎(chǔ)免疫為0. 25~lmg/Kg，加強(qiáng)免疫的劑量為0. 5~lmg/Kg。采用背部皮下多點(diǎn)注射， 每隔15d加強(qiáng)免疫一次，第4次免疫后8~10天內(nèi)，靜脈采血，測(cè)定效價(jià)和特異性，待其血清 效價(jià)和特異性合格后，兔子采用心臟采血，分離出抗血清；或用小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合， 獲得雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而獲得單克隆抗體； (2) 采用辛酸-硫酸銨法或Protein G/A親和層析純化，得到兔抗血清或小鼠腹水中的 免疫球蛋白，即使DEHP抗體。
8. 如權(quán)利要求3所述的DEHP抗體用于制備檢測(cè)鄰苯二甲酸二（α-乙基己）酯在食品 中的殘留量的免疫檢測(cè)劑的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開鄰苯二甲酸二(α-乙基己)酯(英文縮寫DEHP)半抗原、人工抗原和抗體制備及應(yīng)用，屬于食品安全領(lǐng)域。本發(fā)明中以DEHP為原料，經(jīng)硝化反應(yīng)和還原反應(yīng)，制得帶氨基基團(tuán)的中間產(chǎn)物，再與丁二酸酐、戊二酸酐等試劑反應(yīng)生成帶羧基基團(tuán)的半抗原；然后通過活潑脂法或者混合酸酐法與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原。將人工抗原免疫動(dòng)物后產(chǎn)生對(duì)DEHP的特異性抗體。用該抗體建立免疫檢測(cè)可用于DEHP的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，對(duì)實(shí)現(xiàn)食品安全的快速檢測(cè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
【IPC分類】G01N33-53, C07C239-20, C07K16-44, C07K14-77, C07K14-765, C07C233-54, C07C231-02
【公開號(hào)】CN104744294
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410336370
【發(fā)明人】張挺, 譚龍飛, 江津津, 彭述輝, 黎海彬
【申請(qǐng)人】廣州城市職業(yè)學(xué)院
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2014年7月15日