一種化合物及其制備方法及利用其制備多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽合成技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及化合物及其制備方法及利用其制備 多肽的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 趨化因子在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著重要的作用，尤其是介導(dǎo)免疫器官的形成和 對(duì)機(jī)體免疫的監(jiān)控，以及幫助免疫細(xì)胞正常發(fā)育和實(shí)現(xiàn)功能。趨化因子介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞 的趨化運(yùn)動(dòng)在炎癥、腫瘤及AIDS等疾病中均發(fā)揮著病理作用。趨化因子相關(guān)產(chǎn)品已進(jìn) 入臨床應(yīng)用研宄。比如最近發(fā)現(xiàn)，趨化因子CCL21通過與T淋巴細(xì)胞表面的趨化因子受 體CCR7相互作用，誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致了 T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白 血?。˙uonamici.S·，Nature, 2009，459，1000-1004·)。再比如，固態(tài)腫瘤（比如黑 色素瘤）會(huì)通過分泌CCL21，誘導(dǎo)產(chǎn)生類淋巴網(wǎng)狀基質(zhì)骨架，形成一種異化的細(xì)胞因子環(huán) 境，用來招募調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞，從而形成腫瘤所在區(qū)域的抗免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長 (J.D. Shields·, Science, 2010，328，749-752·)。因此，發(fā)展一種靶向 CCL21 的癌癥療 法將是治療癌癥的一個(gè)新途徑。
[0004] 趨化因子CCL21為含有三對(duì)二硫鍵的111肽，它在一些癌癥的形成和生長中起著 重要的作用，靶向CCL21可能為癌癥療法提供新的思路，但是由于其111個(gè)氨基酸和三對(duì)二 硫鍵的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其重組表達(dá)或是通過多肽全合成方法，都較難獲得具有正確結(jié)構(gòu)和 活性的蛋白質(zhì)。目前，由生物重組表達(dá)趨化因子（比如人源CCL21)價(jià)格昂貴（250 ug/7144 CNY，Life Technology)，且無法做到具有藥用價(jià)值的修飾（比如特定的標(biāo)記，PEG化等)，因 此發(fā)展化學(xué)方法高效合成趨化因子，及其各種具有藥用價(jià)值的修飾變體是非常有必要的。
[0005] 化學(xué)合成蛋白質(zhì)的常用策略是首先利用固相多肽合成技術(shù)合成多肽片段，然后在 水溶液中實(shí)現(xiàn)多肽的片段連接。目前使用最成功的多肽片段連接方法是Stephen Kent教授 報(bào)道的自然化學(xué)連接NCL。自然化學(xué)連接策略的基本原理是利用全不保護(hù)的多肽片段1的 C端硫酯單元與多肽片段2的N端半胱氨酸單元發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)，從而將多肽片段1和 多肽片段2拼接為一個(gè)更大的多肽片段。傳統(tǒng)的多肽片段連接，在每次NCL后就要進(jìn)行一 次分離純化，該步驟耗時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)造成產(chǎn)率的較大損失。對(duì)合成較大的蛋白質(zhì)（100-150 氨基酸）時(shí)，發(fā)展多片段的一鍋法合成方法對(duì)提高蛋白合成效率具有非常重要的意義。
[0006] 因此，目前關(guān)于制備多肽的方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商 業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠快速有效地化學(xué)合成多肽和蛋白的手 段。
[0008] -種化合物，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)：
2. -如權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，包括： (1) 使三氟乙酰胺與甲醛反應(yīng)，獲得N-(羥甲基）三氟乙酰胺； (2) 使芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸與三氟乙酸反應(yīng)，獲得Fmoc-L-半胱氨 酸； (3) 使所得N-(羥甲基）三氟乙酰胺與Fmoc-L-半胱氨酸反應(yīng)，即得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種化合物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)包括： (1-1)稱取三氟乙酰胺與碳酸鉀放在圓底燒瓶中； (1-2)量取甲醛水溶液加入到上述圓底燒瓶中； (1-3)在室溫下，步驟（1-2)中所得到的混合物反應(yīng)后，得N-(羥甲基）三氟乙酰胺； 步驟（2)包括： (2-1)將三氟乙酸，三異丙基硅烷與二氯甲烷混合，得混合溶液； (2-2)在室溫下，將芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于（2-1)所得混合溶液中 反應(yīng)，得Fmoc-L-半胱氨酸； 步驟（3)包括： (3-1)在室溫下，將Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中； (3-2)在室溫下，將N-(羥甲基）三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中； (3-3)將（3-2)所得的溶液滴加到（3-1)所得的溶液中； (3-4 )在室溫下，步驟（3-3 )中所得到的混合物反應(yīng)后，即得所述的化合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 稱取10 mmol三氟乙酰胺，I mmol的碳酸鉀于25 ml的圓底燒瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，得第一混合物； 將所述第一混合物在室溫下反應(yīng)6小時(shí)，將所得的反應(yīng)體系直接旋干，得N-(羥甲基） 三氟乙酰胺； (2) 將20 ml三氟乙酸，20 ml二氯甲烷，I ml三苯基硅烷混勻，得第二混合物； 將10 mmol芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室溫下反 應(yīng)1小時(shí)，將所得到反應(yīng)體系旋干，將所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到 Fmoc-L-半胱氨酸； (3) 將10 mmol Fmoc-L-半胱氨酸溶于20 ml三氟乙酸中，向所獲得的混合物中加入所 述溶于三氟乙酸的N-(羥甲基）三氟乙酰胺溶液5 ml，得第三混合物； 在室溫下，將所述第三混合物攪拌過夜，將所得到的反應(yīng)體系有機(jī)相旋干，將所獲得固 體溶于乙腈中，用高效液相色譜分離純化，即得權(quán)利要求1所述的化合物。
5. -種利用權(quán)利要求1所述的化合物制備多肽的方法，其特征在于，包括： (a) 提供第一多肽片段和第二多肽片段，所述第一多肽片段的C端為酰肼基團(tuán)，N端為 三氟乙酰氨甲基保護(hù)的半胱氨酸，所述第二多肽片段的N端為半胱氨酸，所述三氟乙酰胺 甲基保護(hù)的半胱氨酸是利用所述的化合物，通過Fmoc固相合成技術(shù)形成的； (b) 將所述第一多肽片段和第二多肽片段進(jìn)行多肽片段連接反應(yīng)，得到多肽片段連接 產(chǎn)物第三多肽片段； (c) 將步驟（b)中所得到的連接產(chǎn)物第三多肽片段經(jīng)過堿性條件處理，將所述三氟乙酰 胺甲基保護(hù)的半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，得到第四多肽片段，即得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，所述堿性條件 處理是在pH為IL 5-12. 0,37°C下進(jìn)行40分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，步驟（b)包括： (b-Ι)將所述第一多肽片段和亞硝酸鈉接觸，對(duì)所述第一多肽片段的酰肼基團(tuán)進(jìn)行氧 化處理； (b-2)將步驟（b-Ι)中所得到的氧化處理產(chǎn)物與4-巰基苯乙酸溶液混合，并將所得到 混合物的pH調(diào)節(jié)至6,生成對(duì)應(yīng)的多肽疏基苯乙酸硫醋； (b-3)向步驟（b-2)所得到的混合物中添加第二多肽片段，并在pH 6. 5的條件下進(jìn)行 連接反應(yīng)，得連接產(chǎn)物第三多肽片段。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，步驟（c)包括： (c-Ι)將（b-3)所得的反應(yīng)液，用10 M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11. 6 ; (c-2)將（c-Ι)所得的反應(yīng)液，在37°C條件下反應(yīng)40分鐘； (c-3)將（c-2)所得的反應(yīng)液，用12 M鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至6.5,得到第四多肽片段， 即得。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于，所述第四多肽 片段是通過以下步驟獲得的： (a-Ι)通過固相多肽合成方法制備第一多肽片段，所述第一多肽片段的C端形成有酰 肼基團(tuán)，N端形成三氟乙酰氨甲基保護(hù)的半胱氨酸； (a-2)將N端半光氨酸被三氟乙酰胺甲基保護(hù)的第一多肽片段與所述的第二多肽片段 連接，得第三多肽片段； (a-3)將所得含有第三多肽片段的反應(yīng)溶液，調(diào)節(jié)pH至11. 6,在37°C下反應(yīng)40分鐘 后，再調(diào)節(jié)PH至6. 5,得第四多肽片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用化合物制備多肽的方法，其特征在于， 所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列； 所述第三多肽片段具有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列； 所述第四多肽片段具有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化合物及其制備方法及利用其制備多肽的方法，其中該化合物具有如下結(jié)構(gòu)：利用該化合物能夠?qū)⒍嚯腘端的半胱氨酸保護(hù)起來，從而掩蔽N端半胱氨酸的活性，進(jìn)而在多肽片段連接制備蛋白時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)一次將多個(gè)（大于等于3個(gè)）多肽片段進(jìn)行連接，即每連接兩個(gè)多肽片段后不需要進(jìn)行分離純化處理，在解除掩蔽后可直接進(jìn)行與下一個(gè)多肽片段的連接。
【IPC分類】C07C319-14, C07K14-52, C07C323-59
【公開號(hào)】CN104744327
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510033192
【發(fā)明人】鄭基深, 唐姍, 司巖巖
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日