一株深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌及其在產(chǎn)中性蛋白酶中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及深海來(lái)源的蛋白酶生產(chǎn)菌株，具體涉及蠟狀芽孢桿菌 caretsSWJS13)及其液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶是一種廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化工、醫(yī)藥、皮革等行業(yè)的酶制劑，不同蛋白 酶的適用條件及作用的特異性不同，選擇合適的蛋白酶才能得到理想的作用效果。隨著蛋 白酶工業(yè)應(yīng)用條件的多樣化及在新領(lǐng)域的應(yīng)用潛力的發(fā)掘，研宄者們對(duì)探索新型的蛋白酶 資源及高產(chǎn)蛋白酶的菌種始終保持著較高的關(guān)注。海洋生物資源豐富，覆蓋了 70%的地球 表面積，包含了 80%的的生物資源，且開發(fā)程度相對(duì)較低，已研宄和鑒定過(guò)的微生物還不到 總量的5%，已發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)不到總數(shù)的1%，遠(yuǎn)未獲得有效開發(fā)，成為開發(fā)利用的熱點(diǎn)。海 洋環(huán)境與陸生環(huán)境相比的特殊性導(dǎo)致海洋微生物在物種、基因組成、生態(tài)功能、代謝系統(tǒng)和 機(jī)體防御系統(tǒng)上的多樣性，可能產(chǎn)生多種具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的活性物質(zhì)，包括酶制劑。許 多研宄團(tuán)隊(duì)都報(bào)道了海洋微生物所產(chǎn)的酶具有各種象獨(dú)特的性質(zhì)，其中海洋蛋白酶已被報(bào) 道具有適冷、嗜壓、嗜熱及耐有機(jī)溶劑等特性，對(duì)深海菌株所產(chǎn)的蛋白酶進(jìn)行研宄對(duì)開發(fā)新 型蛋白酶具有重要意義。
[0003] 微生物蛋白酶主要由霉菌、細(xì)菌產(chǎn)生，其次是酵母和放線菌，工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶的 菌株主要是芽孢桿菌和霉菌。目前已報(bào)道的海洋來(lái)源的產(chǎn)蛋白酶的菌株主要包括假單胞菌 屬、黃桿菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、氧化短桿菌屬等，對(duì)這些菌株產(chǎn)蛋白酶進(jìn)行研宄可開發(fā) 新的酶制劑生產(chǎn)菌種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌及其在產(chǎn)中性蛋白酶中的應(yīng) 用。
[0005] 本發(fā)明的一株深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌分離自南海深海沉積物樣品，采用酪蛋 白平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩篩選得到，分類命名為蠟狀芽孢桿菌caremSWJS 13)。該菌株已于2013年11月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研宄所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8424。
[0006] 經(jīng)形態(tài)鑒定及生物生化特性研宄，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8424的菌株具有以下特 征：（1)菌落形態(tài)：菌落呈圓形，大小中等，扁平，光滑濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊，乳白色；（2) 細(xì)胞形態(tài)：革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體呈桿狀，有芽孢；（3)生理生化特征：兼性厭氧生長(zhǎng)，能利 用葡萄糖、蔗糖、乳糖，不能利用0 _木糖、阿拉伯糖、甘露醇、西蒙氏檸檬酸鹽，淀粉水解陽(yáng) 性、明膠液化陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性、氧化酶陰性，不產(chǎn)氨，不產(chǎn) H2S，在50°C不能生長(zhǎng)。
[0007] 對(duì)保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8424菌株的16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定， 測(cè)得16SrRNA基因片段長(zhǎng)度為1448bp，具體序列見(jiàn)序列表。該基因序列與Genbank中已登 錄的基因序列進(jìn)行分析得知，該菌株與cerewsstraincpl(JX544748.1)相似 性最高，同源性達(dá) 100%，與模式菌株cerettsstrainATCC14579 (NR_074540. 1) 同源性達(dá)99%。結(jié)合16SrRNA基因序列相似性及形態(tài)、生理生化特征，鑒定該菌株為蠟狀芽 抱桿菌（SWJS13 )。
[0008] 采用單因素試驗(yàn)對(duì)保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8424菌株液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的條件進(jìn)行 了優(yōu)化。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：本發(fā)明采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn) 蛋白酶的條件，其培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易培養(yǎng)，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌SWJS 13,可能成為新型蛋白酶資源的生產(chǎn)菌種，具有重要的后續(xù)開發(fā)及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為不同發(fā)酵溫度對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0011] 圖2為不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0012] 圖3為不同裝液量對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0013] 圖4為不同碳源對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0014] 圖5為不同氮源對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0015] 圖6為不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWJS13產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和包含不限于此， 需指出的是，以下若有為特別詳細(xì)說(shuō)明之處，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。
[0017] 富集及種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉lg，人工海水1L，pH7. 4-7. 6。
[0018] 酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白l〇g，牛肉浸粉3g，磷酸二氫鉀2g，瓊脂粉15g，人工海水 1L,pH7. 4 左右。
[0019] 發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油3g，葡萄糖5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.3g，硫 酸銨lg，氯化鈣lg，海鹽l〇g，PH7. 2。
[0020] 產(chǎn)蛋白酶的CGMCCNo. 8424的分離篩選 富集培養(yǎng)：稱取2g深海海泥樣品樣于50mL滅菌離心管中，加15mL無(wú)菌蒸餾水，充 分混合，在搖床中振搖30min，靜置后取上清液lmL于富集培養(yǎng)中（50mL/250mL)，37°C， 120rpm，培養(yǎng) 48h。
[0021] 初篩：取富集后的培養(yǎng)液lmL加入9mL無(wú)菌生理水中，用倍比法稀釋到不同梯度 (KTiKT7)。選取10_4,10_5,10_ 6,10_7稀釋度，各吸取0.lmL，加入已凝固的酪蛋白培養(yǎng)基中， 涂布均勻。倒置放在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。
[0022] 分離純化：挑選上述酪蛋白平板中有明顯水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上連 續(xù)劃線分離三次以上，直到為純培養(yǎng)物為止。挑選水解圈較大的單菌落保存于試管斜面上， 保藏于4°C冰箱。
[0023] 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩：將上述保藏的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，活化12h， 以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，培養(yǎng)48h。發(fā)酵液在4°C，10000rpm離心lOmin，取上清液即為粗酶液。采用福林（Folin)試劑顯色法測(cè)定中性蛋白酶活力，復(fù)篩出 液體發(fā)酵蛋白酶產(chǎn)量高的菌株。
[0024] 產(chǎn)蛋白酶的CGMCCNo. 8424的鑒定 將活化的CGMCCNo. 8424接種于LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm培養(yǎng)10h，取1. 5mL新鮮 菌液4°C，lOOOOrpm離心5min，收集菌體于2mL離心管中，米用DNA提取試劑盒提取DNA。 電泳檢測(cè)后采用通用引物進(jìn)行PCR(正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物： 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。
[0025] 擴(kuò)增總反應(yīng)體系為（20yL):模板基因DNA0. 5yL;上下游引物（20ymol/1)各 1. 0yL;TaqDNA聚合酶 0? 2yL; 10Xbuffer2. 0yL;4 種脫氧核苷酸混合物dNTP(各 2. 5 mmol/L) 1. 6yL，25mmol/LMgCl2 1. 6yL，雙蒸水（ddH20) 12. 1yL。PCR擴(kuò)增條件：95°C5 min;95°C30s;55°C30s;72°C1.5min;72°C10min;10°C，共 30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純 化后完成測(cè)定的16SrRNA基因基因片段長(zhǎng)度為1448bp，與straincpl (JX544748.1)相似性最高，同源性達(dá)100%,與模式菌株strainATCC 14579 (NR_074540. 1)同源性達(dá)99%，具體序列見(jiàn)序列表。根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征，結(jié) 合16SrRNA基因序列相似性鑒定CGMCCNo. 8424為蠟狀芽孢桿菌SWJS 13)〇
[0026] 蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo. 8424液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的條件優(yōu)化 發(fā)酵溫度的優(yōu)化：分別在20 °C、25 °C、30 °C、37 °C、40 °C下發(fā)酵，裝液量20%，150rpm，培 養(yǎng)48h。測(cè)定不同發(fā)酵溫度下粗酶液的中性蛋白酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1，在25°C下發(fā)酵蛋白酶 活力最高。
[0027] 培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化：分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5、6、7、8、9、10,裝液量 20%，在25°C，150rpm條件下培養(yǎng)48h。測(cè)定培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的影響，結(jié)果見(jiàn) 圖2,培養(yǎng)基初始pH7-9時(shí)發(fā)酵蛋白酶活力都較高。
[0028] 裝液量的優(yōu)化：搖瓶發(fā)酵在250mL錐形瓶中進(jìn)行，裝液量分別為10%、20%、30%、 40%、60%，pH7，在25 °C，150rpm條件下發(fā)酵48h。測(cè)定不同發(fā)酵溫度下粗酶液的中性蛋白酶 活力，結(jié)果見(jiàn)圖3,裝液量在10%或20%時(shí)蛋白酶活力都較高，裝液量繼續(xù)增加時(shí)，蛋白酶產(chǎn) 量迅速降低。
[0029] 碳源的優(yōu)化：分別研宄以0.5%及1.0%的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖作為碳源 時(shí)，菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的能力。結(jié)果見(jiàn)圖4,以0. 5%葡萄糖及蔗糖作為碳源時(shí)，蛋白酶產(chǎn)量 較高，1%葡萄糖作為碳源時(shí)幾乎不產(chǎn)蛋白酶，以乳糖及可溶性淀粉作為碳源時(shí)蛋白酶產(chǎn)量 較低。
[0030] 氮源的優(yōu)化：分別研宄以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、大豆粉、大豆分離蛋白、 尿素及硫酸銨作為氮源時(shí)，菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的能力。結(jié)果見(jiàn)圖5,菌株能夠利用酵母粉、牛 肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨產(chǎn)蛋白酶，其中1%酵母粉為氮源時(shí)酶活最高。
[0031] 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化：在pH7,25°C，裝液量10%，150rpm條件下發(fā)酵，從0-52h每隔4h 連續(xù)取樣，測(cè)定中性蛋白酶產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖6,中性蛋白酶在 40h時(shí)積累量達(dá)到最大，隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，有一定的下降。
[0032] 蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo. 8424遺傳穩(wěn)定性 表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌ceremSWJS 13)，該菌株于2013年11月 1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8424。
2. 權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌cerem SWJS 13)在液體發(fā)酵生產(chǎn)中性 蛋白酶中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株深海來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌及其在產(chǎn)中性蛋白酶應(yīng)用。本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus SWJS 13）于2013年11月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.8424。本發(fā)明對(duì)該菌株產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，其培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易控制，發(fā)酵周期短，蛋白酶活力高，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。CGMCC No. 842420131101
【IPC分類】C12R1-085, C12N9-54, C12N1-20
【公開號(hào)】CN104745504
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510099949
【發(fā)明人】趙謀明, 雷芬芬, 趙強(qiáng)忠, 崔春
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月6日