一株蘇云金孢桿菌及其在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株深海來源的氨肽酶生產(chǎn)菌株，具體涉及蘇云金芽孢桿菌{.Bacillus thuringiensis SffJS 52)及其在液體發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶根據(jù)其作用方式可分為內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。內(nèi)切蛋白酶主要從肽鏈的內(nèi)部切割肽鍵，生成小分子的多肽，外切蛋白酶分為氨肽酶和羧肽酶，分別從肽鏈的N端或C端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個釋放出來。目前大部分常用商業(yè)蛋白酶，如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等都是內(nèi)切蛋白酶，外切蛋白酶的產(chǎn)品相對較少，如風(fēng)味蛋白酶則是氨肽酶與內(nèi)切蛋白酶的復(fù)合物。蛋白酶酶解能在一定程度上改善原料蛋白的營養(yǎng)特性和功能特性，已成為蛋白質(zhì)資源高值化利用的重要途徑。但內(nèi)切蛋白酶在蛋白質(zhì)水解的應(yīng)用中存在兩個主要問題，一是對植物蛋白的酶解效率不高，二是酶解液苦味重。這兩個問題理論上可以由外內(nèi)蛋白酶來解決。
[0003]氨肽酶廣泛存在于動物組織及植物中，研宄者們陸續(xù)研宄了白對蝦肌肉、鯉魚骨骼肌、日本薏仁粉、日本雪松花粉、牛骨骼肌、杏鮑菇、煙草、大豆子葉等來源的氨肽酶，但從動植物組織中提取分離氨肽酶存在提取工藝復(fù)雜、提取效率低等問題。氨肽酶的另外一個重要來源就是微生物，目前已報道的產(chǎn)氨肽酶的菌株主要是米曲霉、紅曲霉、枯草芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌等。不同微生物所產(chǎn)氨肽酶的性質(zhì)、產(chǎn)量都有較大的區(qū)別。本發(fā)明從深海沉積物中分離得到一株產(chǎn)氨肽酶的蘇云金芽孢桿菌，并對其氨肽酶性質(zhì)進(jìn)行了初步的研宄，旨在為氨肽酶產(chǎn)品的開發(fā)提供新的生產(chǎn)菌種及理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株蘇云金孢桿菌及其在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的一株蘇云金孢桿菌分離自南海深海沉積物樣品，采用酪蛋白平板初篩和搖瓶發(fā)酵氨肽酶活性測定復(fù)篩得到，分類命名為蘇云金芽孢桿菌thuringiensis SffJS 52)。該菌株已于2014年9月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研宄所，保藏編號為CGMCC N0.9696。
[0006]對保藏編號為CGMCC N0.9696菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測定，測得16S rDNA基因片段長度為1351bp，具體序列見序列表。該基因序列與Genbank中已登錄的基因序列進(jìn)行分析得知，該菌株與數(shù)據(jù)庫中Bacillus不同菌株的16SrDNA序列性具有99%的相似性，與Bacillus thuringiensis strain 5a相似性最高，同源性達(dá)99%，鑒定該菌株為蘇云金芽孢桿菌thuringiensis SffJS 52)。
[0007]本發(fā)明對保藏編號為CGMCC N0.9696菌株液體發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性、底物特異性進(jìn)行了研宄。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術(shù)效果:本發(fā)明篩選得到一株深海來源的產(chǎn)氨肽酶的菌株蘇云金芽孢桿菌SWJS 52，其氨肽酶反應(yīng)條件溫和，有較強(qiáng)的底物特異性。該菌株可成為新型氨肽酶資源的生產(chǎn)菌種或提供新的氨肽酶編碼基因，具有重要的后續(xù)開發(fā)及工業(yè)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0009]圖1為蘇云金芽孢桿菌SWJS 52產(chǎn)氨肽酶的最適反應(yīng)溫度曲線。
[0010]圖2為溫度對蘇云金芽孢桿菌SWJS 52產(chǎn)氨肽酶穩(wěn)定性的影響曲線。
[0011]圖3為蘇云金芽孢桿菌SWJS 52產(chǎn)氨肽酶的最適反應(yīng)pH曲線。
[0012]圖4為pH對蘇云金芽孢桿菌SWJS 52產(chǎn)氨肽酶穩(wěn)定性的影響曲線。
[0013]圖5為蘇云金芽孢桿菌SWJS 52產(chǎn)氨肽酶的底物特異性比較圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合實例對本發(fā)明的實施作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實施和包含不限于此，需指出的是，以下若有為特別詳細(xì)說明之處，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)的。
[0015]富集及種子培養(yǎng)基:蛋白胨5g，酵母粉lg，人工海水1L，pH 7.4。
[0016]酪蛋白培養(yǎng)基:酪蛋白10g，牛肉浸膏3g，磷酸二氫鉀2g，瓊脂粉15g，人工海水IL’pH 7.2 左右。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油3g，葡萄糖5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.3g，硫酸銨lg，氯化鈣lg，海鹽10g，pH7.2左右。
[0018]產(chǎn)氨肽酶的CGMCC N0.9696的分離篩選
富集培養(yǎng):稱取2g深海海泥樣品樣于50mL滅菌離心管中，加15mL無菌蒸飽水，充分混合，在搖床中振搖30min，靜置后取上清液ImL于富集培養(yǎng)中(25 mL /250mL)，37°C，120rpm，培養(yǎng) 48h。
[0019]初篩:取富集后的培養(yǎng)液ImL加入9mL無菌生理水中，用倍比法稀釋到不同梯度(lO—LlO—7)。選取10Λ 10_5，10Λ 10_7稀釋度，各吸取0.lmL，加入已凝固的酪蛋白培養(yǎng)基中，涂布均勻。倒置放在37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。
[0020]分離純化:挑選上述酪蛋白平板中有明顯水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上連續(xù)劃線分離三次以上，直到為純培養(yǎng)物為止。挑選水解圈較大的單菌落保存于試管斜面上，保藏于4°C冰箱。
[0021]搖瓶發(fā)酵復(fù)篩:將上述保藏的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，活化12h，以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，培養(yǎng)48h。發(fā)酵液在4°C，1000rpm離心1min,取上清液即為粗酶液。采用LNA法測定氨肽酶活力，復(fù)篩出液體發(fā)酵氨肽酶產(chǎn)量高的菌株。
[0022]氨肽酶活性測定:將粗酶液用pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋到合適的濃度，取80 μ L樣品稀釋液加入96孔板中，加20 μ L L-亮氨酸對硝基苯胺(L-leu-pNA)，在40°C準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，加入100 μ L無水乙醇終止反應(yīng)，測定405nm下的吸光值。以不同濃度對硝基苯胺在405nm下的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。40°C每分鐘酶解L-亮氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生I ymol對硝基苯胺所需的酶量即為一個酶活單位。
[0023]產(chǎn)蛋白酶的CGMCC N0.9696的鑒定將活化的CGMCC N0.9696接種于LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm培養(yǎng)10h，取1.5mL新鮮菌液4°C，1000rpm離心5min，收集菌體于2mL離心管中，米用DNA提取試劑盒提取DNA。電泳檢測后采用通用引物進(jìn)行PCR (正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
[0024]擴(kuò)增總反應(yīng)體系為(20 μ L):模板基因DNA 0.5 yL;上下游引物(20μηιο1/1)各l.0yL ；Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L ； 10 X buffer 2.0 μ L ;4 種脫氧核苷酸混合物 dNTP (各 2.5mmol/L) 1.6 μ L，25 mmol/L MgCl2 1.6 μ L，雙蒸水(ddH20) 12.1 μ L0 PCR 擴(kuò)增條件:95°C 5min ；95°C 30 s ；55°C 30 s ；72°C 1.5 min ；72°C 10 min ; 1(TC，共 30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物純化后完成測定的16S rRNA基因基因片段長度為1351bp，與thuringiensisstrain 5a相似性最高，同源性達(dá)99%，與其它Bacillus ^?/?//71§7'(9/75^>5不同菌株的163rDNA序列性達(dá)99%，具體序列見序列表，鑒定CGMCC N0.9696為蘇云金芽孢桿菌thuringiensis SffJS 52)。
[0025]蘇云金芽孢桿菌CGMCC N0.9696所產(chǎn)氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)研宄
最適反應(yīng)溫度:粗酶液通過超濾濃縮、凝膠柱層析后得到電泳純酶，分別在25°C、30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C 測定氨肽酶的活力，以最高活力為100%，以其它溫度下氨肽酶的活力以最高酶活的百分比表示，結(jié)果見圖1。氨肽酶在65°C下活力最高，在50 - 65°C有較高的活力。溫度低于25°C或高于75°C基本無活力。
[0026]熱穩(wěn)定性的研宄:將氨肽酶在25 - 75°C范圍內(nèi)保溫30min后，在65°C下測定殘留的氨肽酶活力，以不保溫時的酶活為100%，結(jié)果見圖2。溫度不高于55°C，保溫30min后活力基本不變，60保溫30min剩余75%左右的活力，溫度高于65°C則較快失活。
[0027]最適pH6.0_10.0的緩沖液稀釋酶液，在65°C下分別測定氨肽酶的活力，結(jié)果見圖3。該氨肽酶的最適反應(yīng)pH為9.5，在pH7.5-9.5范圍內(nèi)有較高的活力，pH超出此范圍則活力低于最高酶活50%。
[0028]pH穩(wěn)定性:將氨肽酶在不同的pH緩沖溶液(pH 3.0-10.0)放置(4°C)不同的時間，然后在pH9.5、65°C下測定氨肽酶活力，以放置Oh時的活力為100%，結(jié)果見圖4。該氨肽酶在pH 6.0-9.0范圍內(nèi)放置48h后仍能保持80%以上的活力。最適pH為9.5，但在pH9.0的緩沖溶液中酶活下降了 20%，在pH 6.0-8.0的緩沖溶液中酶活性先下降，超過6h后活性又恢復(fù)。pH低于5.0時氨肽酶迅速下降至20%左右。
[0029]底物特異性:在相同的條件下，分別測定不同的氨基酸-對硝基苯胺(Leu_/?NA、Phe_/?NA、Ala_/?NA、Arg-/?NA、Glu_/?NA、Lys_/?NA、Pro-/?NA 和 Met_/?NA)作為底物時氨肽酶的活力，以Leu-^NA作為底物時的活力為100%。如圖5可知氨肽酶對Leu-^NA和Met-^NA有較強(qiáng)的底物特異性，氨肽酶活力較高，對Ala-^NA及Pro-^NA有較弱的特異性，對其他底物的則無特異性。
【主權(quán)項】
1.一株蘇云金抱桿菌(Bacillus thuringiensis SWJS 52)，該菌株于 2014 年 9 月 23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9696。
2.權(quán)利要求1所述的蘇云金孢桿菌(Bacillusthuringiensis SWJS 52)在液體發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株蘇云金孢桿菌及其在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用。本發(fā)明從深海沉積物中分離得到產(chǎn)氨肽酶的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）。該菌株于2014年9月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9696。該菌株產(chǎn)氨肽酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，溫度不高于55℃保溫30min活性基本不變；在pH7–9.5的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。該酶對N端為亮氨酸的肽鍵的水解能力最強(qiáng)，對N端為亮氨酸為甲硫氨酸的肽鍵也有一定的水解能力。該氨肽酶可應(yīng)用于食品、飼料等行業(yè)以提高蛋白質(zhì)的利用率、蛋白酶解液脫苦、制備生物活性肽等。CGMCC No. 969620140923
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-07, C12N9-48
【公開號】CN104745505
【申請?zhí)枴緾N201510100238
【發(fā)明人】趙謀明, 雷芬芬, 崔春, 趙強(qiáng)忠
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月6日