逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHX1的cDNA及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXI的cDNA及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柳枝稷起源于北美，是多年生C4草本植物。它適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、耐瘠薄，是最具 發(fā)展?jié)摿Φ哪茉醋魑镏?。?jù)我國當前國情，發(fā)展能源植物應(yīng)以邊際土地為主，柳枝稷有限 的耐鹽能力限制了其栽種范圍，因此篩選出高抗逆的品種具有重要意義。柳枝稷是多倍體， 且兩個生態(tài)型之間遺傳差異較大，因此從宏觀上進行品種篩選異常復(fù)雜。擬解決的方法是 從柳枝稷中分離克隆耐鹽相關(guān)基因并對其進行功能分析，通過基因工程技術(shù)對基因進行改 造，使其在受體植物中實現(xiàn)超表達，獲得耐鹽新品種，進而為柳枝稷在邊際土地的大面積種 植奠定基礎(chǔ)。
[0003] 液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白以液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPase建立的跨膜質(zhì) 子梯度為驅(qū)動力，將Na+區(qū)隔化進液泡，以減輕其對其他細胞器的毒害，這是植物抵御鹽分 脅迫的一種主要方式，在植物的耐鹽機制中起重要作用。NHX1基因是編碼液泡膜Na+/H+逆 向轉(zhuǎn)運蛋白的關(guān)鍵基因，利用生物技術(shù)手段調(diào)控該基因可有效提高植物的耐鹽性。隨著對 植物耐鹽分子機制的深入，過表達NHX1基因已在擬南芥、油菜、小麥、玉米、棉花等高等植 物上得到廣泛應(yīng)用并取得較好成果?？寺≡摶蚴菍嶒灥那疤?。目前，已經(jīng)克隆的植物液 泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因有擬南芥的AtNHXl、小麥的TaNHXl、水稻的OsNHXl、玉米的 ZmNHX1、油菜的BnNHX1、番茄的LeNHX1、柑橘的CNHX1、鹽地堿蓬的SsNHX1、北濱藜的AgNHX1 等。然而，到目前為止液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的研究在柳枝稷中仍未見報道，不利 于柳枝稷載體構(gòu)建、表達調(diào)控及遺傳轉(zhuǎn)化的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為進一步研究柳枝稷泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的分子機理，本發(fā)明的目的是 提供柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXI的cDNA及其克隆方法。
[0005] 本發(fā)明利用同源克隆和RACE方法，克隆了柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基 因PvNHXI，包含完整的開放閱讀框（0RF)及非編碼區(qū)（UTR)，填補了該基因在柳枝稷中無相 關(guān)報道的空白。發(fā)明人結(jié)合同源克隆和RACE克隆技術(shù)，分別獲得帶有重疊部分序列的柳枝 稷PvNHXI基因片段和cDNA的末端序列，序列拼接后獲得該基因的cDNA，最后根據(jù)拼接序列 設(shè)計全長引物進行高保真反應(yīng)，對所得序列進行進一步驗證，為今后開展基因表達、遺傳轉(zhuǎn) 化、功能驗證等研究奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明研究克隆柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXI的cDNA的方法的 具體歷程如下：
[0007] (1)提取柳枝稷的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0008] (2)以cDNA為模板，以特異性引物對1擴增柳枝稷PvNHXl基因核心片段；
[0009] (3)將步驟（2)獲得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特異引物對2進行延伸；將 延伸后的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特異性引物GSP2進行cDNA3'末端的克隆，獲得 3, cDNA ;
[0010] (4)將步驟（2)獲得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特異引物對3進行延伸；將 延伸后的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特異性引物GSP1進行cDNA5'末端的克隆，獲得 5,cDNA;
[0011] (5)將獲得的步驟（2)獲得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段、步驟（3)獲得的 3'cDNA、步驟（4)獲得的5'cDNA進行拼接，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXl的cDNA全長，具有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，全長1739bp，其中包括完整的 開放閱讀框1611bp，編碼的多肽含546個氨基酸，且具有高度保守的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點 (FFHLLPPI)。以此為依據(jù)設(shè)計獲得PvNHXl基因全長特異性引物對。
[0012] 其中，步驟（2)所述特異性引物對1為：
[0013]正向引物：5'ACATCCTCGTCTTCAGCG3'（如 SEQIDNo.2 所示）
[0014]反向引物：5'CTCATCAGTCCAGCCCAC3'（如 SEQIDNo. 3 所示）。
[0015] 其中，步驟（3)所述特異性引物對2為：
[0016]正向引物：5'AITGATGTAGCCGTCGTG3'（如SEQIDNo.4 所示）
[0017]反向引物：5'CTGCTCGGTGGGTGAT3'（如SEQIDNo.5 所示）。
[0018] 其中，步驟（3)所述特異性引物GSP2為：
[0019] 5'TCACCAGCACAATCACTGTCGTCCT3'（如SEQIDNo. 6 所示）。
[0020] 其中，步驟（4)所述特異性引物對3為：
[0021]正向引物：5'CGTGGTGGCGCACCTGGT3'（如 SEQIDNo.7 所示）
[0022] 反向引物：5'TGCAGAAAAGATCGCTCC3'（如 SEQIDNo. 8 所示）。
[0023] 其中，步驟（4)所述特異性引物GSP1為：
[0024] 5,TGGTCGGAGGTGGAGCCCAGCACGCCC3'（如SEQIDNo. 9 所示）。
[0025] 其中，步驟（5)獲得的PvNHXl基因全長特異性引物對為：
[0026]正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如SEQIDNo.10所示）
[0027]反向引物：5'TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如SEQIDNo. 11所示）。
[0028] 且經(jīng)驗證，獲得的PvNHXl基因全長特異性引物對能克隆獲得的柳枝稷液泡膜Na+/ H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXl的cDNA，開放閱讀框1611bp，序列如SEQ ID No. 12所示，編碼 的多肽含546個氨基酸，且具有高度保守的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點（FFIYLLPPI)，與拼接完成 的PvNHXl基因一致。
[0029] 本發(fā)明提供的柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXl的cDNA具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0030] 本發(fā)明提供的克隆柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXl的cDNA的方 法，具體步驟為：
[0031] (1)提取柳枝稷總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0032] (2)以cDNA為模板，以PvNHXl基因全長特異性引物對進行高保真全長PCR反應(yīng)；
[0033] (3)回收和純化步驟（2)的PCR產(chǎn)物，并進行加A反應(yīng)，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHXl的cDNA;
[0034] 所述PvNHXl基因全長特異性引物對為：
[0035]正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如SEQIDNo. 10 所示）
[0036]反向引物：5'TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如SEQIDNo. 11 所示）。
[0037] 其中，步驟（1)所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為37°C孵育60min;反應(yīng)體系為：
【主權(quán)項】
1. 柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的cDNA，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2. 克隆權(quán)利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的cDNA的方 法，其特征在于，具體步驟為： (1) 提取柳枝稷總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; (2) 以cDNA為模板，以PvNHXl基因全長特異性引物對進行高保真全長PCR反應(yīng)； (3) 回收和純化步驟（2)的PCR產(chǎn)物，并進行加 A反應(yīng)，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向 轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的cDNA ; 所述PvNHXl基因全長特異性引物對為： 正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如 SEQ ID No. 10 所示） 反向引物：5' TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如 SEQ ID No. 11 所示)。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為37°C孵育 60min ;反應(yīng)體系為：
總反應(yīng)體系為20 μ 1。
4. 權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)的PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性30sec ; 94°C變性10sec，58°C退火15sec，72°C延伸10sec，35個循環(huán)；72°C延伸5min。；反應(yīng)體系 為：
總反應(yīng)體系為25 μ 1。
5. 權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3)的加 A反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3〇sec ; 94°C變性10sec，58°C退火15sec，72°C延伸10sec，35個循環(huán)；72°C延伸5min。；反應(yīng)體系 為：
總反應(yīng)體系為30 μ 1。
6. 克隆權(quán)利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的cDNA的 PvNHXl基因全長特異性引物對，其為： 正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如 SEQ ID No. 10 所示） 反向引物：5' TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如 SEQ ID No. 11 所示)。
7. 權(quán)利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的cDNA在分子標 記輔助培育高抗逆柳枝稷品種中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2-5任一項所述克隆柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 PvNHXl的 cDNA的方法在分子標記輔助培育高抗逆柳枝稷品種中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求6所述的PvNHXl基因全長特異性引物對在分子標記輔助培育高抗逆柳 枝稷品種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHX1的cDNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還提供克隆權(quán)利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHX1的cDNA的方法，具體步驟為：（1）提取柳枝稷總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；（2）以cDNA為模板，以PvNHX1基因全長特異性引物對進行高保真全長PCR反應(yīng)；（3）回收和純化步驟（2）的PCR產(chǎn)物，并進行加A反應(yīng)，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因PvNHX1的cDNA。本發(fā)明獲得了柳枝稷PvNHX1基因全長cDNA序列的方法，為以后利用該序列進行構(gòu)建載體、遺傳轉(zhuǎn)化等奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68, C12N15-29, C12N15-10
【公開號】CN104745598
【申請?zhí)枴緾N201310729060
【發(fā)明人】張?zhí)N薇, 黃艷華, 楊富裕, 劉斯佳, 杜娟, 路海博, 孫元元
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月25日