一種人激肽釋放酶及其編碼基因和應(yīng)用制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種人激肽釋放酶-1，編碼基因、表達(dá)純化方 式和活性檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 激肽釋放酶（也稱為激肽原酶）是一種絲氨酸蛋白酶，能使激肽原釋放出激肽， 它具有很高的生理活性，在人體組織中起著十分重要的生理作用。激肽釋放酶主要分為兩 類：血楽激肽釋放酶（PlasmaKallikrein，PK)和組織激肽釋放酶（TissueKallikrein， TK)。兩種酶在分子量大小、底物特異性、免疫學(xué)特征和釋放出的激肽方面不盡相同。血漿 激肽釋放酶可參與血凝塊的表面激活、纖維蛋白溶解、激肽生成和炎癥過(guò)程。而組織激肽釋 放酶廣泛存在于腎、胰腺、胃腸道黏膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等許多組織中，它以激肽原酶原的形 式在組織中合成，再經(jīng)胰蛋白酶激活形成組織激肽釋放酶，并可釋放至血液循環(huán)。組織激 肽釋放酶基因是一類大的多成員家族，目前證明人組織激肽釋放酶家族至少由15個(gè)成員 (KLK1-KLK15)組成。
[0003]目前，組織激肽釋放酶已應(yīng)用于臨床，用于糖尿病并發(fā)癥、高血壓及急性缺血性腦 卒中等疾病的治療。較為常見(jiàn)的產(chǎn)品主要有兩類：一類是從豬胰臟提取的激肽釋放酶(例如 常州千紅制藥的"怡開(kāi)")，是以來(lái)源比較廣泛的豬胰臟為原料提取純化而得的組織激肽釋 放酶KLK1。但是，從豬胰臟中提取和純化豬激肽原酶的過(guò)程繁瑣且提取量低，且由于種屬 差異，動(dòng)物源活性蛋白在人體內(nèi)易產(chǎn)生免疫反應(yīng)。另一類是人尿激肽釋放酶(例如廣州天普 的"凱力康")，其主要由人尿中提取，雖然人尿激肽釋放酶生物活性明顯高于豬胰臟激肽釋 放酶，并消除了動(dòng)物來(lái)源蛋白免疫原性的問(wèn)題，但是依然面臨來(lái)源有限、易受病毒污染等問(wèn) 題。因此重組人組織激肽釋放酶(Homosapienskallikreinl，hKl)蛋白的高效制備顯 得極為迫切，而要獲得高效價(jià)廉的重組hKl蛋白，須通過(guò)基因工程技術(shù)大量制備和生產(chǎn)，才 有可能應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)中。
[0004] 迄今為止，國(guó)內(nèi)外采用基因工程的方法利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組hKl蛋白進(jìn)行 了不少研究，但由于種屬差異，hKl天然序列很難直接在酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物常出現(xiàn)序列 不正確、糖基化修飾均一度差、生物活性低、產(chǎn)量低或生產(chǎn)工藝復(fù)雜、涉及有毒試劑難以產(chǎn) 業(yè)化應(yīng)用等問(wèn)題。例如，1998年Chan等得到的重組hKl蛋白電泳時(shí)顯示兩條帶，且無(wú)法證 明產(chǎn)品均一性（ProteinExpressionandPurificationl2, 361 - 370,1998) ;2004 年袁新 清等得到的重組hKl產(chǎn)量?jī)H約40mg/L(人胰激肽原酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，袁新清陳 勁春，北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，Vol. 31，No. 6, 2004)。另外根據(jù)中國(guó)專利申請(qǐng) 200610027754. 1可知，2006年上海萬(wàn)興生物研發(fā)的畢赤酵母表達(dá)重組hKl蛋白工藝，宿主 內(nèi)源蛋白表達(dá)量高，hKl分離純化困難；并且其工藝中采用甲醇作為誘導(dǎo)劑，而甲醇為危險(xiǎn) 有機(jī)試劑，不僅成本提高、存在安全隱患，而且在蛋白后期純化中也可能面臨甲醇?xì)埩舻葐?wèn) 題。另外，上海萬(wàn)興生物以Panomics公司的人腎cDNA文庫(kù)為模板，用PCR法獲得了人hKl 的基因，其162位點(diǎn)上可能存在Glu/Lys兩種氨基酸，這種氨基酸的多態(tài)性及酵母表達(dá)糖修 飾的多樣性導(dǎo)致了產(chǎn)品的不均一。其次，目前檢測(cè)hKl的活性方法主要是利用hKl特異性 水解發(fā)色底物S-2266 (Val-Leu-Arg-pNA)分子中-Arg-pNA之間的化學(xué)鍵而釋放出pNA，利 用游離的PNA在A405值來(lái)比較活性的大小，但是培養(yǎng)基以及畢赤酵母內(nèi)源蛋白的表達(dá)導(dǎo)致 的背景很高，從而使得該測(cè)活方案準(zhǔn)確度很低。
[0005] 除此之外，上海萬(wàn)興生物在培養(yǎng)畢赤酵母表達(dá)重組hKl時(shí)采用的是工業(yè)上常用的 發(fā)酵培養(yǎng)基BSM，該培養(yǎng)基中含有很高的鹽濃度，當(dāng)pH>5以上，BSM培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生很多沉 淀，不利于菌體生長(zhǎng)；而且培養(yǎng)基中的鹽濃度過(guò)高，導(dǎo)致高滲透壓引起發(fā)酵過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞 自溶產(chǎn)生脂類物質(zhì)和增加外源DNA殘留的幾率，為后續(xù)下游純化等工作帶來(lái)很多麻煩，并 易使表達(dá)的蛋白發(fā)生沉淀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)工藝更簡(jiǎn)單、產(chǎn)量更 高，并且表達(dá)產(chǎn)品更均一的表達(dá)系統(tǒng)及與之相適應(yīng)的表達(dá)基因，以及hKl的測(cè)活方法和純 化方法。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組hKl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼上述所述重組hKl蛋白的基因，其堿基序列 如SEQ ID NO: 1所示。該序列是針對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，與天 然序列相比，其更利于hKl在畢赤酵母中表達(dá)。
[0009] 優(yōu)選的，本發(fā)明還在上述所述編碼重組hKl基因之前加入分泌信號(hào)肽，優(yōu)選地，本 發(fā)明的分泌信號(hào)肽序列是專為畢赤酵母分泌表達(dá)到細(xì)胞外的信號(hào)肽；更優(yōu)選地，本發(fā)明的 分泌信號(hào)肽序列是針對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化得到的信號(hào)肽序列，相比之下顯著提高異源 基因在宿主菌中的分泌效率。優(yōu)化后的分泌信號(hào)肽的堿基序列如SEQ ID N0:3所示。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述編碼重組hKl的基因或帶有分泌信號(hào) 肽的編碼重組hKl的基因的載體，優(yōu)選的，所述的載體為pA0815,pPIC9,pPIC9K，pPIC3. 5， pPIC3. 5K，pPICZaA、B、C或pGAPZaA、B、C，更優(yōu)選為pPIC3. 5K，pPICZaA或pGAPZaA。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含上述所述載體的畢赤酵母菌株，優(yōu)選的，所 述畢赤酵母菌株為SMD1168、GS115、KM71、X-33或KM71H，更優(yōu)選為KM71或X-33菌株。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組hKl蛋白的表達(dá)方法，所述方法包含下述步 驟：
[0013] A.構(gòu)建含有上述所述編碼重組hKl的基因或帶有分泌信號(hào)肽的編碼重組hKl的基 因的載體；
[0014]B.將步驟A的載體線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株中，并在合適的條件下培養(yǎng)；
[0015] C?回收純化蛋白質(zhì)。
[0016] 上述所述載體優(yōu)選為pPIC3. 5K，pPICZaA和pGAPZaA。
[0017] 上述所述畢赤酵母菌株優(yōu)選為KM71或X-33菌株。
[0018]更優(yōu)選的，上述所述載體為pGAPZa，并且上述所述畢赤酵母菌株為X-33菌株。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組hKl蛋白酶動(dòng)力學(xué)活性檢測(cè)方法，所述方法 包含下述步驟：
[0020]A.首先將熒光底物Z-Phe-Arg-MCA溶于DMS0中，再用反應(yīng)緩沖液稀釋至反應(yīng)濃 度；
[0021]B.將含有hKl蛋白的培養(yǎng)基加入酶標(biāo)板中，2復(fù)孔，再分別加入熒光底物 Z-Phe-Arg-MCA。振蕩混勻后，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為360-400nm，發(fā)射波長(zhǎng)440-480nm，循環(huán)讀板；
[0022] C.以突光信號(hào)值為縱坐標(biāo)，讀板時(shí)間為橫坐標(biāo)，斜率為突光信號(hào)值和讀板時(shí)間的 比值，算出各個(gè)孔的斜率，斜率越大hKl蛋白活力越高。
[0023] 本發(fā)明提供的hKl酶動(dòng)力學(xué)活性檢測(cè)方法可以用于高通量篩選高表達(dá)hKl的單克 隆畢赤酵母工程菌株或者細(xì)胞株，靈敏度和準(zhǔn)確度都優(yōu)于化學(xué)發(fā)光方法。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組hKl蛋白高效表達(dá)的發(fā)酵改良BSM培養(yǎng)基， 所述改良發(fā)酵BSM培養(yǎng)基配方及制備如下：
[0025]改良發(fā)酵BSM培養(yǎng)基：甘油40g/L，H3P049mL/L，CaS04?2H200. 3g/L，K2S046 . 07g/L， MgS04.711204. 97g/L，K0Hl. 38g/L。121°C滅菌20min，待溫度降到50°C后，用濃氨水調(diào)pH=6。
[0026]微量鹽溶液PMT1 :CuS046.Og/L，KIO. 8g/L，MnS04?H203.Og/L，Na2Mo04?2H200. 2g/ L，H3B030. 2g/L，CaS04?2H200. 5g/L，ZnCl220g/L，F(xiàn)eS04?7H2065g/L，BiotinO. 2g/L，濃硫酸 5mL/L。過(guò)濾除菌，2mL/L添加到改良發(fā)酵BSM培養(yǎng)基中。
[0027] 作為優(yōu)選的，所述發(fā)酵BSM培養(yǎng)基用濃氨水調(diào)節(jié)pH為6. 0-7. 0。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組hKl蛋白純化方法，所述純化方法如下：
[0029]A.將重組hKl發(fā)酵液低溫高速離心收集上清，加入高濃度（NH)2S04溶液，使其在 上清中終濃度為1. 〇m〇l/L，濾膜過(guò)濾。
[0030]B.首先用平衡緩沖液平衡柱子，接著運(yùn)用純化系統(tǒng)將步驟A中預(yù)處理獲得的重 組hKl發(fā)酵液通