6、轉基因煙草對甲醛的抗性檢測
(I)可溶性糖和總蛋白含量的測定:2mM液體HCHO脅迫48h后，野生型和轉基因植株的可溶性總糖含量均上升了 25%，而可溶性總蛋白的含量卻沒有顯著變化；6mM液體HCHO脅迫48h后，轉基因植株的可溶性總糖含量卻上升了 27.3%，野生型的可溶性總糖含量沒有顯著性變化，而野生型煙草可溶性總蛋白的含量相對于轉基因植株呈現出顯著性下降，轉基因煙草可溶性糖的顯著性上升說明了轉基因植株對于HCHO脅迫的耐受性明顯的強于野生型植株，而由于轉基因植株對于HCHO脅迫的耐受性比較強，所以其總蛋白含量變化不大，反觀野生型植株，其總蛋白含量出現的顯著性下降，可能是由于HCHO脅迫導致了相關基因的表達有所下降，致使體內蛋白水平下降，HCHO脅迫也會促使一部分可溶性蛋白降解。
[0016](2)葉綠素含量的測定:2mM液體HCHO脅迫48h后，野生型煙草和轉基因煙草葉片細胞中的葉綠素a含量、葉綠素b含量和總葉綠素含量都沒有出現顯著性變化；6mM時，發(fā)現脅迫48h后野生型煙草和轉基因煙草葉片細胞中的葉綠素a含量都出現了顯著性降低，轉基因煙草葉片細胞中的葉綠素b含量出現顯著性的上升，而野生型煙草葉片細胞中總葉綠素含量出現22%的顯著性下降，轉基因煙草葉片細胞中的總葉綠素含量并沒有顯著性變化；說明在煙草中過量表達擬南芥/??基因能有效降低HCHO對植物的毒害作用，使得轉基因煙草葉片能在較高濃度HCHO脅迫下保持較好的HCHO吸收能力。
[0017](3)過氧化氫(H202)、丙二醛(MDA)和羰基化蛋白(PC)含量的測定:在2mM HCHO處理48h后H2O2含量在野生型和轉基因植株葉片中并未出現上升反而出現了輕微下降，而6mM HCHO處理48h后野生型和轉基因植株葉片中H2O2含量都出現了上升，大約分別上升了42.1%和45.7%，說明高濃度HCHO處理后會導致煙草細胞受到的氧化損傷，在2mM HCHO處理48h后MDA含量在野生型和轉基因植株葉片中只有不顯著的上升，但是經過6mM HCHO處理48h后，兩者都顯著上升，而轉基因煙草葉片中MDA含量比野生型煙草減少了 28.2% ;在2mM HCHO處理48h后PC含量在野生型和轉基因植株葉片中并未出現顯著性變化，但是在6mM HCHO處理48h后，野生型植株葉片中PC含量升高了 25.2%，轉基因植株葉片中PC含量升高了 14.5% ;說明HCHO脅迫會導致煙草中膜脂過氧化和蛋白質過氧化水平都顯著性升高，但是通過在煙草葉片細胞中過量表達/??基因能有效的降低這種氧化脅迫的發(fā)生。
[0018]實驗結果顯示本發(fā)明的重組載體pH2-PrbcS-T*_/^%在轉基因植株中的應用可提高其對甲醛的吸收速率和抗性。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明中pMD19-T_/^%的克隆策略；
圖2為本發(fā)明中入門載體pENTR-PrbcS-T*-/^%的克隆策略；
圖3為本發(fā)明中植物表達載體pH2-PrbcS-T*-/^%的克隆策略；
圖4為本發(fā)明中FDH基因在轉基因煙草基因組中整合情況與轉錄水平的檢測；其中A:基因在轉基因煙草基因組中整合情況檢測:正對照模板(PC)為pH2-Prbcs-T*-粒，負對照模板(WT)為野生型煙草基因組，1-7為經抗生素篩選出的轉基因煙草株系；其中B: /??基因在轉基因煙草中轉錄水平檢測:正對照模板(PC)為pH2-Prbcs-T*-/^%質粒，負對照模板(WT)為野生型煙草CDNA，5-7為經基因組PCR檢測的陽性插入轉基因煙草株系；圖5為本發(fā)明中FDH蛋白在轉基因煙草中表達水平與蛋白定位的檢測結果；其中A:FDH蛋白在轉基因煙草中表達水平檢測結果:正對照(PC)為擬南芥中提取的總蛋白，負對照(WT)為野生型煙草中提取的總蛋白，5-7為有外源基因轉錄的轉基因煙草株系；其中B:5、6和7號轉基因煙草的葉綠體FDH蛋白的定位檢測結果；
圖6為本發(fā)明中過量表達擬南芥/??煙草葉片的液體HCHO吸收曲線；其中A:2mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比，CK空白對照為未放入任何植物葉片的2mMHCHO溶液用于監(jiān)測HCHO的揮發(fā)；B:2mM植物凈吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；WT為野生型煙草；
圖7為本發(fā)明中過量表達擬南芥/??煙草葉片的液體HCHO吸收曲線；其中A:4mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比。B:4mM植物凈吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；CK為空白對照，WT為野生型煙草；
圖8為本發(fā)明中過量表達擬南芥/??煙草葉片的液體HCHO吸收曲線；其中A:6mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比；B:6mM植物凈吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；CK為空白對照，WT為野生型煙草； 圖9為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總糖含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總糖含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總糖含量；
圖10為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總蛋白含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總蛋白含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中可溶性總蛋白含量；圖11為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素a含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素a含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素a含量；
圖12為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素b含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素b含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中葉綠素b含量；
圖13為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中總葉綠素含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中總葉綠素含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中總葉綠素含量；
圖14為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中H 202含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中H 202含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中H 202含量；
圖15為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中MDA含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/?辨專基因煙草葉片中MDA含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中MDA含量；
圖16為本發(fā)明中液體HCHO脅迫下WT和/??轉基因煙草葉片中PC含量變化情況；其中A:2mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中PC含量；B:6mM HCHO溶液處理Oh和48h時WT和/??轉基因煙草葉片中PC含量。
【具體實施方式】
[0020]本實施例中試劑主要分為分子生物學實驗試劑、植物遺傳轉化所需的培養(yǎng)基以及轉基因植物鑒定和檢測所需的各種試劑；各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、質粒提取試劑盒等為寶生物工程有限公司(大連)產品，TRIzoLReagent RNA 提取試劑盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit 購自 Invitrogen 公司，其余試劑均為國產分析純。
[0021]本實施例中儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。
[0022]所有引物序列均在大連寶生物公司合成，本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0023]實施例1: /??因cDNA的PCR擴增及TA克隆
從GenBank中查找擬南芥/??基因的cDNA序列，并設計一對序列如下的引物:
上游引物 5’ GCATGCCGATGAGACAAGCCGCTAAGGCAA3’ (Sphl)，
下游引物 5’ CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA3’ (Xhol)；
上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位點；下游引物3’末端加XhoI酶切位點，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴增，得到/??基因的全長cDNA。
[0024]用TRIzoL Reagent (Invitrogen)從擬南芥{Arabidopsis thaliana)幼苗中提取總RNA，取植物嫩葉約0.lg，加入Iml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0.2ml氯仿，振蕩混勾，離心15min (12000rpm)，轉移上清液至新管，加Λ 0.5ml異丙醇，混勾室溫放置10min，4°C離心1min (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ I焦