一種檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著工業(yè)廢水和生活污水中氮元素含量的增加，導(dǎo)致湖泊、河口等地表水體富營養(yǎng)化程度加劇，破壞水體生態(tài)平衡，為緩解這一過程，降低污水中氮元素含量勢在必行。
[0003]目前污水中的氮元素主要通過脫氮微生物降解去除，包括硝化和反硝化過程，其中硝化反應(yīng)包括氨氧化菌將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮的過程以及亞硝酸鹽氧化菌將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的過程，亞硝酸鹽氧化菌是脫氮的第二個(gè)環(huán)節(jié)，也是反硝化得以實(shí)現(xiàn)的前提，污水中亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度是脫氮系統(tǒng)穩(wěn)定高效運(yùn)行的關(guān)鍵性因素，迫切需要檢測分析污水生物處理系統(tǒng)中該菌屬的群落結(jié)構(gòu)和豐度。
[0004]傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)中，主要依靠純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行特殊菌株分離后檢測，該技術(shù)應(yīng)用范圍窄，條件苛刻，無法應(yīng)用于實(shí)際污水系統(tǒng)中相關(guān)微生物的檢測，由于生物脫氮系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌組成復(fù)雜，培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻，現(xiàn)階段很難進(jìn)行亞硝酸鹽氧化菌的純培養(yǎng)，考慮到純培養(yǎng)技術(shù)的局限性，近年來分子生物學(xué)技術(shù)逐步應(yīng)用于污水生物處理系統(tǒng)中微生物的檢測。目前，分子生物學(xué)技術(shù)檢測污水生物處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的手段主要有16S rDNA序列片段擴(kuò)增檢測、熒光原位雜交檢測技術(shù)(FISH)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real time Q-PCR)等?！兑恢戤愷B(yǎng)型亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的分離及其降解特性的研宄》(李焱生等，生物技術(shù)通報(bào)，2010年第5期)中純化培養(yǎng)了一株異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化菌，并對(duì)菌株16S rDNA序列片段擴(kuò)增進(jìn)行檢測鑒定。該文章純化培養(yǎng)僅培養(yǎng)了某一種細(xì)菌，難以覆蓋實(shí)際環(huán)境中所有的亞硝酸鹽氧化菌，而本文應(yīng)用的16S rDNA序列片段擴(kuò)增檢測分析過程偏差較大，難以應(yīng)用到實(shí)際環(huán)境中微生物的檢測。研宄者目前針對(duì)亞硝酸鹽氧化菌的定量檢測方法主要是FISH技術(shù)和Real time Q-PCR技術(shù)；專利公開號(hào)CN 101348836A，專利名稱“一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法”一文中發(fā)明了一種FISH技術(shù)來檢測硝化細(xì)菌，該技術(shù)操作復(fù)雜，步驟繁瑣，探針特異性差、要求高，無法全面覆蓋亞硝酸鹽氧化菌的全部種屬。此外，專利公開號(hào)CN 103555831 A，專利名稱“污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌焚光定量PCR檢測方法” 一文中以QPCR為技術(shù)手段，針對(duì)亞硝酸鹽氧化菌的兩個(gè)主要種屬進(jìn)行定量檢測分析，該定量技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品制作困難大，標(biāo)準(zhǔn)曲線難以統(tǒng)一，且實(shí)驗(yàn)檢測成本高，群落結(jié)構(gòu)分析困難，難以大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)際污水廠相應(yīng)微生物的群落結(jié)構(gòu)分析和豐度檢測。
[0005]Franck Poly 等以 nxrA 功能基因檢測硝化菌屬(“First explorat1n ofNitrobacterdAysiVj in soils by a PCR cloning-sequencing approach targetingfunct1nal gene nxrA ^ FEMS MICROB1LOGY ECOLOGY，2008 (64):132-140);Michael Pester等以nxrB功能基因檢測硝化螺菌“NxrB encoding the betasubunit of nitrite oxidoreductase as funct1nal and phylogenetic marker fornitrite-oxidizing Nitrospiray\ Environmental Microb1logy，(2014) 16 (10)，3055 -3071)，但是將nxrA和nxrB功能基因同時(shí)用于檢測亞硝酸鹽氧化菌仍未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)解決上述檢測分析技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡單、準(zhǔn)確的亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的檢測方法，該方法不僅可以應(yīng)用于實(shí)際污水處理系統(tǒng)中相關(guān)微生物的實(shí)時(shí)監(jiān)測，還可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)的微生物檢測，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，具體步驟如下:
Ca)提取污水中活性污泥的全部基因組DNA ;
(b)以全部基因組DNA為模板，以上游引物序列SEQID N0.1和下游引物序列SEQ IDN0.2進(jìn)行nxrA基因PCR擴(kuò)增；
以全部基因組DNA為模板，以上游引物序列SEQ ID N0.3下游引物序列SEQ ID N0.4進(jìn)行nxrB基因PCR擴(kuò)增；
(c)以羅氏454焦磷酸測序法分別nxrA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和nxrB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；
(d)采用Mothur軟件分別對(duì)nxrA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果和nxrB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果劃分操作分類單元；
Ce)選取具有97%相似度的操作分類單元序列與GenBank進(jìn)行BLASTn比對(duì)，根據(jù)BLASTn比對(duì)結(jié)果，選擇相似度> 95%的序列，利用MEGA軟件分別對(duì)nxrA基因和nxrB基因劃分系統(tǒng)進(jìn)化樹，即為污水中亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)；
nxrA基因和nxrB基因的不同操作分類單元的相對(duì)豐度即為污水中亞硝酸鹽氧化菌的豐度。
[0007]本發(fā)明中，步驟b所述nxrA基因PCR擴(kuò)增是指:
反應(yīng)體系:10Xbuffer 3 μ L，25mmol/L 的 MgCl2L 8 μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0.2 μ L，1mM的dTNPl.4 μ L，濃度均為1mM的正向引物SEQ ID N0.1和反向引物SEQ ID N0.2各
0.3 μ L，20ng/ μ L的DNA模板2 μ L，無菌雙蒸水補(bǔ)足至30 μ L ;
反應(yīng)條件:94°C下變性1min ；94°C 30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)35次；72°C下延伸5min。
[0008]本發(fā)明中，步驟b所述nxrB基因PCR擴(kuò)增是指:
反應(yīng)體系:10 X buffer 3 μ L，25mmol/L 的 MgCl2L 8 μ L，濃度為 5U/μ L 的 Taq 酶 0.2μ L，1mM的dTNPl.4 μ L，濃度均為1mM正向引物SEQ ID N0.3和反向引物SEQ ID N0.4各0.3 μ L，20ng/ μ L的DNA模板2 μ L，無菌雙蒸水補(bǔ)足至30 μ L ;
反應(yīng)條件為:4°C下變性910min ；94°C 30s, 50°C _58°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)35次；72°C下延伸5min。
[0009]本發(fā)明的有益效果在于:以實(shí)際污水生物處理系統(tǒng)活性污泥中微生物總DNA為模板，覆蓋活性污泥中所有的微生物，檢測范圍廣；亞硝酸鹽氧化菌屬于硝化菌屬和硝化螺菌屬，因此本發(fā)明分別對(duì)功能基因nxrA和nxrB進(jìn)行擴(kuò)增污水中亞硝酸鹽氧化菌群，特異性強(qiáng)；以羅氏454焦磷酸測序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序序列全面、準(zhǔn)確、快速；本發(fā)明能夠檢測分析亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度，既可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的檢測分析，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)污水廠脫氮效率的實(shí)時(shí)監(jiān)測。
【附圖說明】
圖1為實(shí)施例nxrA基因OTUs序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析示意圖；
圖2為實(shí)施例nxrB基因OTUs序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析示意圖；
圖3為實(shí)施例亞硝酸鹽氧化菌的群落豐度和分布示意圖；
圖4為實(shí)施例nxrB基因OTUs的豐度示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)Poly et al.2008文獻(xiàn)中的引物進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)nxrA基因的特異性擴(kuò)增正反向引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為322bp。
[0011]選取GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為 FP929003.1 的 Ca.Nitrospira defluvii 全基因組中nxrB基因，和其他相似度99%以上的部分nxrB基因序列作為引物設(shè)計(jì)模板，設(shè)置最佳的引物參數(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，nxrB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為506bp。
[0012]nxrA 基因正向引物 SEQ ID N0.1:5’-GGGTACAAGAAGTGCGTGGA-3’ ；nxrA基因反向引物SEQ ID N0.2:
5’-CTTGCCGTGGATCTGGGTC-3’
nxrB 基因正向引物 SEQ ID N0.3:5’ -CAGACCGACGTGTGCGAAAG-3’nxrB 基因反向引物 SEQ ID N0.4:5’ -TCCACAAGGAACGGAAGGTC-3’。
[0013]實(shí)施例2污水處理廠好氧池活性污泥中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度檢測 Cl)活性污泥中微生物總DNA的提取
樣品取某城市污水處理廠好氧池的活性污泥，采用美國MP B1medicals公司生產(chǎn)的FastDNA 土壤自旋提取試劑盒對(duì)活性污泥樣品提取總DNA，操作嚴(yán)