一種用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐 藥基因的引物、探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)金黃色葡萄球菌隸屬于葡萄球菌 屬（Staphylococcus)，硬壁菌門（Firmicutes)，革蘭染色陽性。金黃色葡萄球菌無芽孢、 鞭毛，可有莢膜，能產(chǎn)生金黃色色素，能分解甘露醇，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)、乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及脫 氧核糖核酸酶試驗(yàn)陽性。青霉素的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了抗生素用于感染治療的時(shí)代，金黃色葡萄 球菌引起的感染性疾病得到較好的控制，但隨著青霉素的普遍使用，金黃色葡萄球菌表 現(xiàn)出耐藥性。之后，科學(xué)家研宄出一種新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林 (Methicillin)。1961英國科學(xué)家Jevons首次報(bào)道分離出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，至今 MRSA 感染幾乎遍及全球， 已成為院內(nèi)感染及社區(qū)感染的重要病原菌之一，被稱為"超級細(xì)菌"。MRSA具有較高的感染 率和致死率，金黃色葡萄球菌可引起一系列的化膿性感染、食物中毒及中毒性休克綜合征 等，其化膿性感染從小的皮膚感染病變?nèi)绨X、癰到嚴(yán)重的感染如組織壞死、壞死性肺炎、骨 髓炎和心內(nèi)膜炎等。
[0003] 由于抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的感染率逐漸上升，MRSA的 治療非常棘手，因此，早期診斷和及時(shí)有效的治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也就越發(fā)重 要了。但是現(xiàn)有技術(shù)中并沒有針對MRSA的早期診斷的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有針對MRSA的早期診斷的方法，本發(fā)明實(shí)施例提供了一 種用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的引物、探針和試劑盒。所述技術(shù)方案如 下：
[0005] 一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因 的引物和探針，所述引物和探針包括：用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的正 向引物、用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反向引物和用于檢測耐甲氧西林 金黃色葡萄球菌耐藥基因的探針，其中，
[0006] 所述用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示；
[0007] 所述用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示；
[0008] 所述用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0009] 所述探針的5'端連接有熒光基團(tuán)FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述 探針的 3' 端連接有淬滅基團(tuán) TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基 因的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物和探針。
[0011] 具體地，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、臨界陽性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控 品、陰性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012] 具體地，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括：工作標(biāo)準(zhǔn)品1、工作標(biāo)準(zhǔn)品2、工作標(biāo)準(zhǔn)品3和工作 標(biāo)準(zhǔn)品4,其中，
[0013] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品1為1 x 107拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥的 基因片段；
[0014] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品2為1 X 106拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥的 基因片段；
[0015] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品3為1 X 105拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥的 基因片段；
[0016] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品4為1 X 104拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥的 基因片段。
[0017] 具體地，所述陽性質(zhì)控品為1. OX 106拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 耐藥的基因片段。
[0018] 具體地，所述正向引物和所述反向引物的終濃度均為0. 05-0. 9 yM，所述探針的終 濃度為 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具體地，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括：終濃度為0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR緩沖液和終濃度為 1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
[0020] 具體地，所述核酸釋放劑包括：無菌水、終濃度為0. 03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯 基醚、終濃度為0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值為8. 3的終濃度為0. 01-0. 1M 的三（羥甲基）氨基甲烷。
[0021] 具體地，所述臨界陽性質(zhì)控品為1. ox 104拷貝/mL的所述耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌耐藥基因的基因片段。
[0022] 具體地，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理鹽水。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的引物和探針，具有靈敏度高的特性，能夠在MRSA的 早期診斷出結(jié)果，為MRSA早期治療起到至關(guān)重要的作用，同時(shí)，本發(fā)明實(shí)施例提供的用于 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的試劑盒，可在MRSA的早期診斷出結(jié)果，且具有 靈敏度高的特性，采用儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，其檢測結(jié)果可靠，提 高了檢測的靈敏度。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0025]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0026]圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例4提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例5提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0029] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例5提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；